電刺激小腦頂核對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織管內皮細胞生長因子及其受體的影響.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是指在圍產期窒息缺氧等因素導致腦的缺氧缺血性損害，臨床上出現一系列腦病的表現。重度患兒常遺留腦癱、癲癇、智力障礙、共濟失調等后遺癥，給家庭和社會造成極大的負擔。因此，尋找有效的防治HIBD方法對于提高新生兒的存活率，降低致殘率，搞好優(yōu)生優(yōu)育，提高我國人口素質，具有重要的意義。
　　 缺氧缺血后腦組織血運供應的改善與神經元功能的恢復密切相

2、關。血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一組近年來新發(fā)現的血管新生因子，是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，也是血管發(fā)生和神經營養(yǎng)因子，不僅能促進血管的新生，還能直接作用于神經細胞發(fā)揮神經營養(yǎng)和神經保護的作用。
　　 目的
　　 近年來，物理治療方法如電刺激、功能訓練、針灸、按摩等在腦缺血疾病的治療過程中越來越受到重視，而電刺激目前治療成年腦

3、缺血性疾病的療效已得到肯定，但對HIE恢復期的療效在國內外卻少有報道，更缺少實驗證據。本實驗通過制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，給予電刺激其小腦項核，利用免疫組化方法來觀察腦組織中VEGF及其受體的表達，并通過記憶能力測試，探討電刺激對腦保護作用的機制。
　　 材料與方法
　　 1.分組
　　 新生7日齡健康SD大鼠105只，雌雄不限，體重12-16g，隨機分成A、B兩組。每組又分為對照組、模型組、電刺激組，A

4、組各25只，B組各10只。A組在造模術后又按1天、3天、7天、14天、21天隨機分成5組，每組各5只。
　　 2.Rice法模型制作
　　 新生7日齡健康SD大鼠，乙醚吸入麻醉，取頸左側切口，游離左頸總動脈，用絲線結扎，縫合切口，置于缺氧箱中，持續(xù)充以氣流量為2L/min的8：92氧氮混合氣體2h。對照組僅分離出左側頸總動脈，不結扎也不缺氧。術后夾尾左旋是制模成功的標志，據此納入實驗。
　　 3.電刺激治療方法<

5、br>　　 電刺激組在術后12 h開始刺激治療，每次電刺激30分鐘，刺激部位為耳后相當于人乳突處，每日1次，電刺激強度為3.5V、頻率50HZ，使大鼠肢體稍有震顫為宜。對照組與模型組不予電刺激治療，僅予相應時段捕捉固定。
　　 4.標本采集與制備
　　 A組三組大鼠每組分別于術后1天、3天、7天、14天、21天隨機各取5只大鼠，應用乙醚麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，以20ml注射器連接5號頭皮針經左心室心尖部

6、先灌注9g/L鹽水50ml，然后灌注40g/L多聚甲醛溶液。沿頸部斷頭，眼科鑷剝離顱骨，離斷視神經和延髓完整取出腦組織，取以海馬為中心的腦組織，40g/L多聚甲醛固定24h，將腦組織沿視交叉和正中隆起處做冠狀切開，分別做冠狀切片，進行VEGF及VEGFR1、VEGFR2的免疫組化檢測，并對切片進行病理學指標的檢測。
　　 5.指標測定
　　 5.1腦組織HE染色
　　 光學顯微鏡下觀察結果。
　　 5.2

7、腦組織VEGF及VEGFR1、VEGFR2的測定
　　 高倍光鏡下觀察大鼠海馬區(qū)VEGF及VEGFR1、VEGFR2陽性細胞數的表達，胞核染成棕黃色者判為陽性表達產物。利用Image-pro plus6.0軟件系統(tǒng)對切片進行平均光密度測定，每張切片隨機選取5個視野，取其平均值。
　　 5.3記憶能力測試
　　 采用Y迷宮實驗。于手術后第28天對B組各組大鼠進行迷宮實驗測試，以連續(xù)10次測試中有9次正確的反應為達到

8、學會的標準，記錄每一動物迷路分辨學習達到標準前所需要的測試數和正確反應率。24 h后重復以上實驗的過程。
　　 6.統(tǒng)計學分析：
　　 采用SPSS for windows13.0進行統(tǒng)計分析，方法為單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，數據均以x±s表示，以α=0.05為顯著性檢驗水準。
　　 結果：
　　 1.HE染色結果：
　　 對照組神經細胞形態(tài)正常，胞質豐富，細胞排列整齊緊密，

9、細胞核清楚，核仁明顯，胞漿染色均勻，胞膜完整。模型組海馬區(qū)錐體細胞變性，細胞間隙增大，排列紊亂，正常神經元減少，可見大量明顯的壞死灶，壞死中心區(qū)呈空泡樣變，神經細胞數量減少，胞質皺縮，核濃縮深染，核仁消失，胞漿疏松，間質水腫。電刺激組神經細胞變性壞死較少，損傷程度明顯減輕，海馬區(qū)錐體細胞及神經元存活數量多，多數細胞形態(tài)相對正常。
　　 2.VE6F、VE6FR1、VE6FR2免疫組化染色：
　　 電刺激組各個時間點VEG

10、F及VEGFR1、VEGFR2表達均高于模型組和對照組(P<0.05)；模型組各個時間點VEGF及VEGFR1、VEGFR2表達均高于對照組(P<0.05)；電刺激組和模型組VEGF表達于第3天達高峰，持續(xù)14天開始下降至21天仍有表達，VEGFR1、VEGFR2表達于第7天達到高峰，持續(xù)14天開始下降至21天仍有表達；對照組各個時間點的VEGF及VEGFR1、VEGFR2表達無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.記憶能力測試

11、：
　　 模型組大鼠第1天達標所需反應次數顯著多于對照組，正確反應率顯著低于對照組，第2天復測仍有相似結果，而電刺激組第1天達標所需反應次數顯著低于模型組，正確反應率也顯著高于模型組，各組相比均有顯著意義(P<0.05)；在模型組，第2天正確率未見明顯提高，與第1天相比P>0.05，余均見明顯提高(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.電刺激可促進HIBD新生大鼠腦組織VEGF及其受體VEGFR1、VEGFR