芥酸合成基因表達(dá)的量化分析及芥酸種質(zhì)資源的TRAP分子鑒定.pdf

1、油菜是世界最重要的油料作物之一，是僅次于大豆的第二大植物油脂來(lái)源。油菜中的脂肪酸因其廣泛用途和質(zhì)量高、價(jià)格低、可再生的特點(diǎn)，在現(xiàn)代化工業(yè)中顯示越來(lái)越重要的作用。高芥酸油菜的研究也被人們所熱切關(guān)注并在不斷的深入，現(xiàn)己培育出芥酸含量大于50﹪的油菜育種材料。新疆以種植芥菜型油菜為主，現(xiàn)有品種的芥酸含量相對(duì)較低，達(dá)不到工業(yè)上要求的水平。 植物中芥酸的生化合成是由脂肪酸延長(zhǎng)酶(fatty acid elongase,FAE)復(fù)合體催化。

2、FAE包括四種酶：β-酮脂酰-CoA合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase，KCS)、β-酮脂酰-CoA還原酶(β-ketoacyl．CoA reductase，KCR)、β-羥脂酰．CoA脫水酶(β-hydroxyacyl-CoAdehydrase，HCD)和烯脂酰-CoA還原酶(enoyl-CoA reductase，ECR)。 為了探索芥菜型油菜中芥酸的形成，有效利用種質(zhì)資源，為高芥酸育種提供理論依據(jù)，本文

3、研究了芥酸合成基因的表達(dá)及芥酸種質(zhì)資源的TRAP(Target region amplified-polymorohism)．分子鑒定。利用相對(duì)定量RT-PCR對(duì)芥菜型高芥酸油菜全生育期葉片和種子中的KCR、HCD表達(dá)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)量化分析。進(jìn)一步比較了KCR基因家族中KCRl和KCR2在高芥酸和低芥酸油菜中的表達(dá)差異。并以芥酸合成基因?yàn)榘形稽c(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(TRAP)標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外33份芥酸種質(zhì)資源進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 利

4、用同源植物基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物、RT-PCR獲得了芥菜型油菜芥酸合成功能基因(KCR，HCD，ECR)片段的序列，目前在芥菜型油菜基因庫(kù)中還不能直接檢索到。 KCR、HCD在高芥菜型油菜全生育期的葉片和種子中均有表達(dá)；在油菜開花期，KCR、HCD在葉片中的相對(duì)表達(dá)量上升；在種子發(fā)育25天時(shí)在種子中表達(dá)量達(dá)到最高。在種子發(fā)育第5天，KCRl在高芥酸芥菜型油菜種子中表達(dá)均高于同時(shí)期低芥酸芥菜型油菜種子中的表達(dá)。 建立并優(yōu)

5、化TRAP體系。確定在10μL的體系中固定引物濃度為4pmol.μL<'-1>，隨機(jī)引物濃度為0.4pmol.μL<'-1>，MgCl<,2>濃度為3.0mmol.L<'-1>，dNTP的濃度為0.20mmol.L<'-1>,Taq酶的濃度為0.1U.L<'-1>，DNA模板為50～100ng。優(yōu)化后的體系擴(kuò)增條帶較多、清晰，重復(fù)性好。該體系的建立為油菜種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記輔助育種搭建了技術(shù)平臺(tái)。 利用TRAP標(biāo)記能將33份芥

6、酸種質(zhì)資源完全分開。第一等級(jí)劃分以12.5為閾值，可分為兩大類，海甘藍(lán)(Crambe abyssrinica)為一類，蕓薹屬材料為一類。揭示了材料屬間存在很大的遺傳差異和種內(nèi)較高的遺傳相似性。第二等級(jí)劃分以10為閾值，可將蕓薹屬品種劃分成3個(gè)大類，第一類共1個(gè)，為白菜型油菜材料，編號(hào)為3；第二類共22個(gè)品種，為芥菜型油菜，分別為4，5，6，7，8，9，10，11，15，16，17，18，19，20，21，27，28，29，30，31，3