樹突狀細(xì)胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分肝癌相關(guān)重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及在肝癌樹突狀細(xì)胞疫苗免疫治療研究中的應(yīng)用 目的:利用攜帶甲胎蛋白(α—fetoprotein，AFP)基因的重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno—associatedvirus，rAAV)轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)體外誘導(dǎo)抗肝癌免疫應(yīng)答。并通過構(gòu)建肝癌細(xì)胞特異性rAAV，將IFN—γ基因?qū)敫伟┘?xì)胞進(jìn)一步增強(qiáng)rAAV/AFP—DC疫苗誘導(dǎo)的抗肝癌免疫應(yīng)

2、答。 方法: 1.攜帶IFN—γ基因的肝癌細(xì)胞特異性rAAV(rAAV/IFN—γ)的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增甲胎蛋白啟動(dòng)子(AFPpromoter，AFPp)、白蛋白啟動(dòng)子(Albuminpromoter，ALBp)和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子(cytomegalovirusenhancer，CMVe)、β—actin增強(qiáng)子(β—actinenhancer，βe)，并按不同的組合插入到rAAV載體中。將含有不同啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的rAAV分

3、別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2和Hep3B，篩選出表達(dá)活性最強(qiáng)的rAAV。利用篩選出的rAAV轉(zhuǎn)染其他非肝癌細(xì)胞株，驗(yàn)證rAAV的肝癌組織特異性。將IFN—γ基因插入到肝癌細(xì)胞特異性rAAV載體中，利用rAAV/IFN—γ轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B，檢測IFN—γ的表達(dá)水平及對(duì)HLA—classⅠ分子表達(dá)的影響。 2.rAAv/AFP—DC體外誘導(dǎo)抗肝癌免疫應(yīng)答：利用rAAV/AFP轉(zhuǎn)染來源于HLA—A2陽性健康志愿者的DC制備肝癌

4、疫苗，檢測rAAV/AFP—DC疫苗的表型、AFP表達(dá)及細(xì)胞因子分泌。rAAV/AFP—DC疫苗體外刺激自體T淋巴細(xì)胞，觀察對(duì)T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子分泌的影響。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測并比較活化的T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株和rAAV/IFN—γ轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株的殺傷作用。 結(jié)果: 1.結(jié)果表明rAAV/ALBp在Hep3B中表達(dá)活性最強(qiáng)，而rAAV/CMVeAFPp在HepG2中的表達(dá)活性最強(qiáng)，并且這兩種病毒在其他所有檢測的非肝癌細(xì)胞株中均沒

5、有表達(dá)活性。rAAV/ALBp/IFN—γ和rAAV/CMVeAFPp/IFN—γ分別轉(zhuǎn)染Hep3B和HepG2后，兩種細(xì)胞均能有效表達(dá)IFN—γ，并且HLA—classⅠ分子表達(dá)水平顯著上調(diào)。 2.rAAV/AFP—DC能夠有效表達(dá)AFP，表面分子CD80、CD83、CD86、CD40、HLA—DR、CD1a表達(dá)上調(diào)，并大量分泌IL-12。rAAV/AFP—DC疫苗體外刺激自體T淋巴細(xì)胞大量增殖，檢測發(fā)現(xiàn)增殖的T細(xì)胞主要為CD

6、8+CD69+活化的殺傷性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，而CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulativeTcell，Treg)則較少，并且活化的T細(xì)胞大量分泌IFN—γ，而不分泌IL—4。CTL對(duì)Hep3B和HepG2均有不同程度的殺傷作用，并且rAAV/IFN—γ轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)。 結(jié)論: 篩選出的兩種肝癌細(xì)胞特異性rAAV具有相對(duì)的肝癌組織特異性，為

7、肝癌的治療提供了一種靶向性的載體工具。rAAv/AFP—DC疫苗體外能夠誘導(dǎo)出有效的抗肝癌免疫應(yīng)答。rAAV/IFN—γ轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，能夠增強(qiáng)CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，從而建立了一種增強(qiáng)DC疫苗誘導(dǎo)的抗肝癌免疫應(yīng)答的新方法，為研究出更有效、更特異的抗肝癌免疫療法奠定了基礎(chǔ)。 第二部分病人腫瘤組織來源腎癌細(xì)胞與異體樹突狀細(xì)胞融合疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床反應(yīng) 目的：腎細(xì)胞癌(renalcellcarcino

8、ma，RCC)已經(jīng)被證明對(duì)免疫治療比較敏感，本研究旨在探討病人腫瘤組織來源腎癌細(xì)胞與異體樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)融合疫苗誘導(dǎo)抗腎癌免疫反應(yīng)。 方法: 將10例HLA—A2陽性腎癌病人的原代腎癌細(xì)胞與來源于HLA—A2陽性健康志愿者的DC融合。通過流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測融合細(xì)胞的表型。在體外實(shí)驗(yàn)中，用異體DC/RCC融合細(xì)胞刺激自體T淋巴細(xì)胞，檢測T細(xì)胞的增殖、IFN—γ分泌及殺傷性T細(xì)胞(c

9、ytotoxicTlymphocytes，CTL)活性。在臨床試驗(yàn)中，10例病人分別免疫接種異體DC/RCC融合細(xì)胞疫苗，觀察副作用和毒性，并通過CT掃描來評(píng)估臨床反應(yīng)。 結(jié)果: 融合細(xì)胞同時(shí)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原和DC表面分子。在體外實(shí)驗(yàn)中，融合細(xì)胞能夠刺激自體T細(xì)胞大量增殖并分泌IFN—γ，同時(shí)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腎癌細(xì)胞CTL反應(yīng)。在體內(nèi)試驗(yàn)中，免疫接種沒有產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用、毒性及自身免疫反應(yīng)，而病人外周血中T細(xì)胞亞群的比例顯著