人類白細(xì)胞抗原G(HAL-G)在胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 檢測(cè)人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá),初步探討其在胃癌免疫逃逸中的作用機(jī)理及臨床意義,并評(píng)估其在胃癌診斷和預(yù)后中的價(jià)值。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)HLA-G及Tregs在179例胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常胃組織中的分布及表達(dá)情況,探討其與胃癌臨床病理特點(diǎn)及復(fù)發(fā)預(yù)后的關(guān)系。
　　 2.應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)HLA-G在30例胃癌組織及

2、相應(yīng)癌旁正常胃組織中的表達(dá),證實(shí)HLA-G的表達(dá)在癌組織與正常組織間存在差異。
　　 3.應(yīng)用RT-PCR、Real-time PCR和Flow Cytometry檢測(cè)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28和HGC-27中HLA-G的表達(dá)。
　　 4.應(yīng)用脂質(zhì)體2000將pVITR02-mcs vector-HLA-G及對(duì)照空載體pVITRO2-mcsvector分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系S

3、GC-7901內(nèi),利用潮霉素B進(jìn)行穩(wěn)篩后分別稱為SGC-7901-G和SGC-7901-V細(xì)胞系。然后利用Real-time PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HLA-G的表達(dá)。并與健康人PBMC進(jìn)行共培養(yǎng),檢測(cè)培養(yǎng)體系中CD3+CD25+FoxP3+T細(xì)胞的變化,同時(shí)應(yīng)用酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平。探討HLA-G在胃癌

4、免疫逃逸中可能的作用機(jī)理。
　　 5.應(yīng)用ELISA法對(duì)82例胃癌、52例淺表性胃炎、36例萎縮性胃炎、39例胃上皮內(nèi)瘤變及67例健康體檢者血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),比較不同組間sHLA-G表達(dá)水平的差異及其與胃癌臨床病理特點(diǎn)間的關(guān)系,同時(shí)應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CEA的表達(dá)水平。運(yùn)用ROC曲線評(píng)估sHLA-G及CEA在胃癌早期診斷中的價(jià)值,將二者進(jìn)行比較,探討sHLA-G在胃癌早期診斷及臨床應(yīng)用中的價(jià)值。
　　 結(jié)果:
　　

5、 1.免疫組化染色結(jié)果顯示,胃癌組織中HLA-G的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)49.7％(89/179),而癌旁正常胃組織中無(wú)表達(dá)(0/179),二者相比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HLA-G的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、鄰近臟器受侵及臨床分期顯著相關(guān)(P＜0.05),而與年齡、性別、腫瘤大小、Borrmann分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。HLA-G陽(yáng)性患者的5年總體生存率、腫瘤相關(guān)生存率及無(wú)病生存率均顯

6、著低于HLA-G陰性表達(dá)者(P＜0.05)。Cox回歸多因素分析的結(jié)果顯示HLA-G陽(yáng)性表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后因素。腫瘤中Tregs的浸潤(rùn)與胃癌的浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器侵犯以及臨床分期相關(guān)(P＜0.05),而與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、Borrmann分期(P＞0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Tregs高浸潤(rùn)胃癌患者的5年總體生存率、腫瘤相關(guān)生存率及無(wú)病生存率均顯著低于低Tregs浸潤(rùn)胃癌患者(P＜0.05)。Cox回歸多因素分析結(jié)果顯

7、示高Tregs浸潤(rùn)是獨(dú)立的預(yù)后因素,且HLA-G的表達(dá)和Tregs的浸潤(rùn)呈顯著相關(guān)。
　　 2.Western Blot結(jié)果顯示HLA-G在胃癌組織中出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,約39kDa大小,而對(duì)照組(癌旁正常組織)中均無(wú)條帶出現(xiàn),進(jìn)一步證實(shí)HLA-G在胃癌組織中表達(dá)而在正常胃組織中不表達(dá)。
　　 3.HLA-G mRNA及蛋白在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28和HG-C-27中均低表

8、達(dá);SGC-7901轉(zhuǎn)染HLA-G(SGC-7901-G)并穩(wěn)篩后,經(jīng)檢測(cè)HLA-G mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。
　　 4.健康人PBMC與SGC-7901-G細(xì)胞系共培養(yǎng),與SG-C-7901-V共培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)體系中CD3+CD25+FoxP3+T細(xì)胞顯著上調(diào),同時(shí),SGC-7901-G共培養(yǎng)體系上清中IL-6和IL-10顯著上調(diào),TNF-α顯著下調(diào)。
　　 5.胃癌組血漿中sHLA-G(138.76U/

9、ml)表達(dá)水平均顯著高于胃上皮內(nèi)瘤變組(57.28U/ml)、萎縮性胃炎組(55.55U/ml)、淺表性胃炎組(46.03U/m)及健康對(duì)照組(39.28U/ml)(P＜0.001);胃上皮內(nèi)瘤變組血漿sHLA-G水平顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.05);而胃上皮內(nèi)瘤變與淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組之間,淺表性胃炎組與萎縮性胃炎組之間以及淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組與健康對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。胃癌組血漿CEA水平顯著高

10、于其他各組(P＜0.01)。并且胃癌患者血漿sHLA-G水平與患者年齡及腫瘤大小顯著相關(guān)(P＜0.05),而與患者性別、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。sHLA-G診斷的ROC曲線AUC為0.814,顯著高于CEA的ROC曲線AUC0.692(P=0.01)。sHLA-G和CEA聯(lián)合檢測(cè)診斷的ROC曲線AUC為0.846,顯著高于sHIA-G或CEA(P＜0.001)。提示sHLA-G的診斷價(jià)值要

11、比CEA優(yōu)越,兩者聯(lián)合診斷優(yōu)于單獨(dú)診斷,結(jié)果具有更高的敏感性和特異性,從而進(jìn)一步證實(shí)sHLA-G單獨(dú)或者與其他傳統(tǒng)標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用有助于胃癌的早期診斷。
　　 結(jié)論:
　　 1.HLA-G在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁正常胃組織,HLA-G的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者的總體生存率、腫瘤相關(guān)生存率和無(wú)病生存率顯著相關(guān),是影響預(yù)后的獨(dú)立因素,提示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。
　　 2.腫瘤組織中Tregs的浸潤(rùn)

12、顯著高于正常組織,HLA-G陰性患者呈現(xiàn)Tregs低浸潤(rùn),相反,HLA-G陽(yáng)性表達(dá)的患者呈現(xiàn)Tregs高浸潤(rùn),兩者呈顯著陽(yáng)性相關(guān)。同時(shí),Tregs浸潤(rùn)與胃癌病變浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官侵犯以及臨床分期呈明顯相關(guān)。Tregs高浸潤(rùn)患者的5年總體生存率、腫瘤相關(guān)生存率及無(wú)病生存率顯著低于Tregs低浸潤(rùn)者。
　　 3.HLA-G過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞系SGC-7901與健康人PBMC共培養(yǎng)后,CD3+CD25+FoxP3+T細(xì)胞顯著