堿基切除修復(fù)抑制劑甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯治療惡性腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是成人神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,手術(shù)全切除率很低,復(fù)發(fā)率高,當(dāng)前多種治療效果仍不理想。欖香烯屬國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥,臨床研究發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤療效確切,而且還具有提高和改善機(jī)體免疫功能,與放化療協(xié)同作用等獨(dú)特效果。但是腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的DNA損傷修復(fù)機(jī)制,會對化療藥物產(chǎn)生抗性。因此抑制這種內(nèi)在的DNA修復(fù)過程,如堿基切除修復(fù)抑制劑甲氧胺的聯(lián)合應(yīng)用有利于提高化療藥物的抗瘤效果。此外,納米脂質(zhì)體能有選擇性地增加藥物在預(yù)期作用部

2、位的濃度而提高治療指數(shù),并提供持續(xù)性的藥物釋放。納米脂質(zhì)體承載欖香烯的應(yīng)用將有望成為一種新型的靶向性治療膠質(zhì)瘤的有效途徑。本課題研究內(nèi)容分兩部分。
　　 第一部分:甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察β-欖香烯單獨(dú)及與甲氧胺聯(lián)合用藥在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程中是否具有協(xié)同作用,以期減少β-欖香烯用量,降低毒副反應(yīng),為β-欖香烯在抗膠質(zhì)瘤治療方面的應(yīng)用提供理論支持。
　　 方法：

3、　　 (1)體外實(shí)驗(yàn)：聯(lián)合運(yùn)用β-欖香烯與堿基切除修復(fù)抑制劑甲氧胺,分別以MTT、Western-blot、彗星試驗(yàn)、γ-H2AX焦點(diǎn)定量分析等方法檢測聯(lián)合用藥的體外抑瘤效果；
　　 (2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立裸鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植動(dòng)物模型,分5組給藥,空白對照組,β-欖香烯(ELE)組,甲氧胺(MX)組,ELE+MX聯(lián)合用藥組,陽性對照順鉑(DDP)組。定期觀察腫瘤生長情況,測量腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線并計(jì)算抑瘤率。
　　

4、 結(jié)果：
　　 (1)體外實(shí)驗(yàn)表明,甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯能顯著抑制C6.SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長,其增殖抑制效應(yīng)也隨之增強(qiáng)；Westemblot檢測結(jié)果表明,ELE+MX組γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯增多,但與單獨(dú)ELE用藥組比較未見明顯差異；彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯處理膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞后,DNAH ％、DNAT％、TL、TM和OTM分別為58.26±3.46％、41.74±3.46％、

5、32.77±9.12、13.87±4.77和14.07±3.84(與對照組比,P<0.05；P<0.01)；γ-H2AX焦點(diǎn)形成結(jié)果顯示,甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯處理的細(xì)胞中有近14％其細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量為大于20個(gè),8 h后,有約29％的細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量大于20個(gè)(與對照組比,P<0.05；P<0.01)。
　　 (2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,給藥前,各治療組腫瘤平均體積與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

6、至第16天,各治療組的腫瘤平均體積顯著小于對照組(P<0.05,或P<0.01)。協(xié)同給藥組RTV亦顯著小于對照組(P<0.05,或P<0.01),且協(xié)同給藥組的T/C為51.6％,小于欖香烯、甲氧胺的單獨(dú)用藥組。
　　 第二部分：納米脂質(zhì)體承載欖香烯誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討納米脂質(zhì)體承載欖香烯誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用及對相關(guān)基因caspase-3表達(dá)的影響。
　　 方法：欖香烯納米

7、脂質(zhì)體的制備；以同等劑量的欖香烯-納米脂質(zhì)體、普通欖香烯和空白培養(yǎng)液作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,分別以MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測聯(lián)合用藥對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡情況,以免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)MTT結(jié)果顯示,欖香烯-納米脂質(zhì)體能顯著抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長,其增殖抑制效應(yīng)也隨之增強(qiáng)；
　　 (2)欖香烯-納米脂質(zhì)體和普通欖香烯組細(xì)胞于48h和7

8、2h時(shí)出現(xiàn)了明顯的凋亡,而且其凋亡率明顯高于空白對照組。
　　 (3)欖香烯-納米脂質(zhì)體和普通欖香烯組細(xì)胞48h和72h時(shí)出現(xiàn)了明顯的Caspase-3蛋白表達(dá),而且其蛋白表達(dá)率明顯高于空白對照組。
　　 結(jié)論：
　　 (1)甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯對C6、SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用,其增殖抑制作用具有明顯的劑量-時(shí)間依賴性。
　　 (2)甲氧胺能增強(qiáng)β-欖香烯對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞造成的DNA損傷