雌激素對(duì)去卵巢EAE大鼠MMP-9、TGF-β及BBB影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性的破壞已成為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和人類多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雌二醇(estradiol，E2)治療Wistar大鼠去卵巢后EAE，觀察臨床療效和潛在的免疫學(xué)機(jī)制，目的在于探討EAE的發(fā)病機(jī)制和應(yīng)用E2治療EA

2、E的作用機(jī)制，為今后臨床應(yīng)用雌激素輔助治療MS等CNS自身免疫性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：制備去卵巢EAE動(dòng)物模型，隨機(jī)分為EAE組、E2治療組和佐劑組。E2治療組從免疫后(post-inoculation,p.i.)0～8天每日肌注E2(250μg/kg)一次。按照國(guó)際通用的五分法評(píng)估臨床癥狀，觀察體重變化、發(fā)病率等臨床指標(biāo)。觀察各組在不同時(shí)間點(diǎn)的血清E2濃度及血清和腦脊液中白蛋白含量比值(CSF to serum al

3、bumin quotient，QA)，通過(guò)QA評(píng)定BBB的損害。在p.i.8、11、14、17天處死動(dòng)物，采用Western blot和免疫熒光法檢測(cè)各組基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)；利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CNS中不同部位轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)的表達(dá)。采用SPSS13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
　　

4、 結(jié)果：
　　 1.大鼠去卵巢后血清E2水平迅速下降，經(jīng)E2(250μg/kg.d)連續(xù)補(bǔ)充9天后其水平迅速升高，當(dāng)停止補(bǔ)充E2后其又以較快的速度代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。在p.i.8、11、14天，E2治療組血清E2水平較EAE組顯著升高(F=1532.63，P＜0.05)。在p.i.17天，E2治療組血清E2代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。
　　 2.EAE組在p.i.11天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，起病突然，發(fā)病輕重不一

5、，表現(xiàn)有尾麻痹、后肢無(wú)力、體重下降等。在p.i.14天左右發(fā)展為發(fā)病高峰期，進(jìn)一步表現(xiàn)為后肢癱瘓、易激惹、體重迅速下降，個(gè)別處于瀕死狀態(tài)。在p.i.17天左右病情開(kāi)始緩解，臨床癥狀減輕，體重開(kāi)始回升，相應(yīng)的臨床癥狀評(píng)分下降。E2治療組的發(fā)病率、平均體重減輕、平均癥狀評(píng)分、平均病灶數(shù)、平均發(fā)病日期，這5項(xiàng)臨床指標(biāo)與EAE組比較均明顯減少或延遲，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3.EAE組在p.i.8天時(shí)QA值已明顯升高(0

6、.36±0.04)，BBB受損較重，之后隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，QA值逐漸下降，BBB的功能逐漸恢復(fù)。E2治療組免疫后初期QA值僅有小幅度的增加，在p.i.14天時(shí)達(dá)到最大值(0.18±0.03)，但增幅較小，出現(xiàn)峰值的時(shí)間較EAE組延遲，BBB受損較輕。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.8～17天，EAE組與E2治療組比較，QA值總的變化趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.26，P＜0.05)。
　　 4.EAE、E2治療和佐劑組

7、的腦和脊髓中均有MMP-9表達(dá)。Western blot顯示一條譜帶位于92KD處，代表MMP-9酶原形式，另一條位于83KD處，代表MMP-9活性形式。Western blot及熒光免疫組化檢測(cè)表明：EAE組MMP-9表達(dá)較佐劑組高(P＜0.05)，E2治療組與EAE組相比顯著減低(P＜0.05)。EAE組MMP-9的表達(dá)與癥狀評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.87，P＜0.05)。
　　 5.TGF-β主要由進(jìn)入CNS的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生

8、，免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為由血管滲出的淋巴細(xì)胞周圍有不同程度著色。結(jié)果顯示：EAE組、E2治療組TGF-β的表達(dá)程度與病情輕重相反。經(jīng)圖像分析顯示，E2治療組TGF-β平均積分光密度在炎癥活動(dòng)高峰期p.i.14天時(shí)達(dá)到最大值3259.16±541.62，與EAE組(1086.59±214.49)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=17.36，P＜0.05)，表明E2治療組TGF-β表達(dá)高于EAE組。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.8～17

9、天，EAE組與E2治療組TGF-β平均積分光密度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=23.35，P＜0.05)，表明E2治療組TGF-β表達(dá)明顯高于EAE組。
　　 結(jié)論：
　　 1.去卵巢后EAE血清E2水平降低，經(jīng)補(bǔ)充E2后明顯升高，當(dāng)停止補(bǔ)充E2后又以較快的速度代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。
　　 2.繼早期BBB損傷高峰之后，EAE臨床癥狀開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸加重。
　　 3.EAE發(fā)病高峰期脊髓MMP-9表達(dá)明顯上調(diào)