Ⅰ型干擾素和分泌IL-10的B細胞對新生期炎癥反應的負調(diào)控.pdf

1、新生期(neonatal period)指的是動物剛出生后的一段時間，人類為0至28天，而小鼠為0至7天。新生期動物的一大特征是對病原微生物高度易感，獲得性免疫應答(adaptive immune response)表現(xiàn)為抗體應答水平低，T細胞免疫通常偏向Th2途徑。獲得性免疫應答低下被認為是新生期動物對病原微生物高度易感一個因素，但其重要性及是否存在其它機制尚有待于進一步闡明。天然免疫(innate immunity)是抵抗外源微生物

2、入侵的第一道防線，在抗感染免疫的早期起關鍵作用，同時天然免疫處于獲得性免疫的上游，不但為激活獲得性免疫所必需，而且決定獲得性免疫的方向和強度。天然免疫的啟動是天然免疫細胞通過模式識別受體識別病原微生物中保守的分子配體而實現(xiàn)的，其中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是最重要的一類受體。目前對新生期天然免疫的研究較少，且缺乏系統(tǒng)性，新生期天然免疫功能是否正常還存有爭議。本文以新生期小鼠為研究對象，應用體內(nèi)和體外實

3、驗對新生期天然免疫系統(tǒng)進行了比較全面的研究，證明了新生期天然免疫細胞在TLR配體的刺激下功能正常，揭示了CD5+B細胞對其它天然免疫細胞炎性應答負調(diào)控的新機制，該機制為新生期動物對病原微生物高度敏感的原因提供了新的可能解釋。 新生期小鼠對TLR配體的炎性應答首先測定了新生期小鼠在注射TLR配體后體內(nèi)的炎性應答，同時以成年鼠組作為對照。注射TLR9配體CpG后，從成年鼠的脾臟和肝臟中可檢測出高水平的炎性細胞因子(TNF-α，IL-

4、1β，IL-6和IL-12)，而在新生期小鼠的相應器官未能或僅能檢測到很低水平的炎性細胞因子。與此對應的是，絕大多數(shù)成年鼠死于D-氨基半乳糖(D-galactosamine)預致敏的、CpG誘導的炎癥反應，而新生期小鼠卻在攻擊后存活。采用其它TLR配體(Pam3CSK4[TLR2-L]，Poly I：C[TLR3-L]，LPS[TLR4-L]和R848[TIR7-L])也得到類似的結(jié)果，這說明與成年鼠相比，新生期小鼠在體內(nèi)炎性應答方面存

5、在缺陷。在本實驗條件下，炎性細胞因子主要由天然免疫系統(tǒng)的樹突細胞(dendriticcells，DC)和CDllb+髓系細胞(myeloid cells，包括單核細胞，巨噬細胞，粒細胞等)產(chǎn)生。為研究新生期小鼠的這些天然免疫細胞是否存在功能上的缺陷，采用胞內(nèi)細胞因子染色或純化細胞的方法，測定了新生期常規(guī)樹突細胞(conventional dendritic cells，cDC)、漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoid dendrit

6、ic cells，pDC)和CDllb+髓系細胞在TLR配體刺激下分泌炎性細胞因子的能力。結(jié)果在這些體外試驗中發(fā)現(xiàn)，與成年鼠相比，新生期天然免疫細胞功能上并不存在缺陷，刺激后可分泌正常水平的炎性細胞因子。白介素10(interleukin 10，IL-10)是最重要的炎性負調(diào)節(jié)分子之一。在CpG誘導的休克模型中，IL-10缺失的新生期小鼠顯示與野生型成年鼠相似的高敏感性，并在體內(nèi)產(chǎn)生高水平的炎性細胞因子，這說明在新生期這個階段，小鼠在體

7、內(nèi)炎癥誘導方面不存在發(fā)育上的缺陷。 以上結(jié)果提示： 1 新生期小鼠天然免疫細胞本身功能正常，但在體內(nèi)存在著對這些天然免疫細胞炎性反應的負調(diào)節(jié)機制，并且IL-10可能起關鍵作用。 2 新生期CD5+B細胞對新生期小鼠炎癥反應的抑制IL-10缺失的新生期小鼠對CpG的高敏感性說明了體內(nèi)產(chǎn)生的IL-10對炎性反應控制的重要性。前期的研究發(fā)現(xiàn)，在CpG刺激下，小鼠新生期CD5+B細胞是抗炎細胞因子IL-10的主要來源。新

8、生期CD5+B細胞占全部B細胞的15％～30％，而這類細胞在成年鼠B細胞中的比例小于2％。除CpG外，CD5+B細胞也在其它TLR配體Pam3CSK4，LPS和R848刺激下產(chǎn)生大量的IL-10。體外共培養(yǎng)試驗證明，來自于CD5+B細胞的IL-10抑制了新生期cDC，pDC和CDllb+髓系細胞等天然免疫細胞分泌炎性細胞因子的能力，而且這種抑制不依賴于細胞間的直接接觸。 分泌IL-10的CD5+B細胞抑制新生期炎性應答的重要性進

9、一步在體內(nèi)實驗中得到證實。B細胞或CD5+B細胞缺失的新生期小鼠在注射CpG后，體內(nèi)的炎性細胞因子水平上升，并且恢復了對D-氨基半乳糖預致敏的休克模型的敏感性。在預先接受新生期B細胞或CD5+B細胞輸注后，IL-10缺失或B細胞缺失的新生期小鼠能夠免于CpG誘導的休克反應。因此，分泌IL-10的CD5+B細胞在體內(nèi)控制了新生期小鼠的炎癥反應。 3 I型干擾素通過分泌IL-10的CD5+B細胞控制新生期炎癥反應在新生期小鼠pDC與

10、CD5+B細胞的共培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，在CpG和R848刺激下，除了B細胞產(chǎn)生的IL-10顯著抑制了pDC分泌I型干擾素(IFN-α和IFN-β)和其它炎性細胞因子外，CD5+B細胞產(chǎn)生的IL-10顯著高于CD5+B細胞單獨培養(yǎng)時產(chǎn)生的水平。這說明pDC促進了B細胞IL-10的分泌。在所測定的pDC產(chǎn)生的細胞因子中，只有IFN-α和IFN-β顯著提高CpG刺激下新生期B細胞IL-10的分泌。當pDC與I型干擾素受體缺失的新生期B細胞共培養(yǎng)時

11、，pDC失去增強新生期B細胞分泌IL-10的能力，證實pDC產(chǎn)生的I型干擾素是促進B細胞IL-10產(chǎn)生的關鍵分子。cDC和髓系細胞以相同的機制通過分泌I型干擾素來增加B細胞IL-10的產(chǎn)生。為進一步研究I型干擾素在新生期炎性應答中的作用，測定了I型干擾素受體缺失的小鼠體內(nèi)的炎性應答。與野生型新生期小鼠相比，I型干擾素受體缺失的新生期小鼠在注射CpG后產(chǎn)生明顯的炎癥反應，并且恢復對D-氨基半乳糖預致敏的休克模型的敏感性。相反的現(xiàn)象卻出現(xiàn)在

12、成年鼠，I型干擾素受體缺失的成年鼠比正常對照組產(chǎn)生顯著減弱的炎癥反應，并且對CpG引發(fā)的休克模型不敏感。這說明I型干擾素在成年期促進而在新生期抑制炎癥反應。 I型干擾素在新生期對炎癥反應的抑制依賴于CD5+B細胞和IL-10的存在，因為在缺乏CD5+B細胞或IL-10的情況下，I型干擾素促進新生期炎性應答。研究發(fā)現(xiàn)只有野生型新生期小鼠B細胞，而不是I型干擾素受體缺失的新生期小鼠B細胞可以保護IL-10缺失的新生期小鼠免于CpG誘

13、導的致死性休克，從而進一步說明I型干擾素在體內(nèi)通過增強B細胞產(chǎn)生IL-10來控制新生期小鼠的炎癥反應。 結(jié)論: 新生期屬于一個特別的時期，一方面，生長代謝旺盛且許多器官的發(fā)育還不完善，需要一個穩(wěn)定的生長環(huán)境。許多研究表明，這個時期的炎癥反應將導致生長發(fā)育遲緩，嚴重的可導致死亡。新生期面對大量的外源微生物，需要迅速建立針對這些炎癥誘導物的耐受，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。另一方面，新生期的炎癥反應應答低下將導致不能有效清除病原微生

14、物，從而造成對病原微生物的高度敏感。本研究表明，新生期小鼠的天然免疫細胞在功能上不存在缺陷，在TLR配體的刺激后可產(chǎn)生正常的炎性應答，但是這種能力在體內(nèi)卻被一群分泌IL-10，具有負調(diào)節(jié)功能的CD5+B細胞亞群所控制，這種控制是受發(fā)育調(diào)控的，因為新生期是CD5+B細胞亞群發(fā)生的高峰期，隨著小鼠的生長，CD5+B細胞的產(chǎn)生逐漸減少。另一個重要的發(fā)現(xiàn)是，I型干擾素顯著增加CD5+B細胞IL-10的分泌，而且在體內(nèi)CD5+B細胞負調(diào)節(jié)作用依賴