發(fā)熱伴病毒調(diào)控細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的研究.pdf

1、研究背景:
　　發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一種新發(fā)的自然疫源性疾病。該種疾病的主要臨床表現(xiàn)是急性發(fā)熱、白細(xì)胞和血小板減少、消化道癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。該病病原體為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)，簡稱發(fā)熱伴病毒，于2009年被于

2、學(xué)杰教授團(tuán)隊(duì)首次分離發(fā)現(xiàn)。隨后韓國和日本也相繼報(bào)道了SFTSV實(shí)驗(yàn)室確診感染病例。此外，在美國跟印度亦發(fā)現(xiàn)了與SFTSV感染類似的病例，其病原體分別被命名為Heartland病毒和Malsoor病毒，這兩種病毒的基因與SFTSV高度同源。由此可見，SFTSV作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒在全球分布范圍廣泛。SFTS疾病病死率較高，目前已有文獻(xiàn)報(bào)告的最高病死率在30％左右。鑒于其分布廣泛且病死率較高，對(duì)該種疾病的及時(shí)臨床診斷和轉(zhuǎn)歸預(yù)測分析變得尤為重

3、要。
　　既往研究證實(shí)，病毒感染會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞因子水平紊亂。感染登革熱病毒后，在出現(xiàn)了出血熱綜合征的重癥病人血清中，TGF-1β和IL-8的含量顯著高于普通感染者。在致病性Ebola病毒感染者血清中，IFN-γ水平顯著升高，IL-2、IL-10、IFN-α等細(xì)胞因子水平也有不同程度的升高。既往研究中SFTS病人血清細(xì)胞因子含量檢測結(jié)果不盡相同:研究發(fā)現(xiàn)SFTS病人血清中某些細(xì)胞因子，如TNF-α、G-CSF、IL-6、IL-10、

4、IFN-γ等含量高于健康人群。然而也有研究發(fā)現(xiàn)SFTS病人血清中IFN-γ、 RANTES、PDGF等細(xì)胞因子含量低于健康人群。Ⅰ型干擾素是機(jī)體固有免疫應(yīng)答過程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，體外研究發(fā)現(xiàn)SFTSV的NSs蛋白能夠抑制Ⅰ型干擾素通路信號(hào)傳導(dǎo)，但目前針對(duì)SFTS病人血清中Ⅰ型干擾素含量的檢測甚少，因此十分有必要對(duì)SFTS病人急性期血清細(xì)胞因子，尤其是Ⅰ型干擾素的濃度進(jìn)行全面準(zhǔn)確的檢測，以探尋SFTSV感染對(duì)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的調(diào)控機(jī)制，分析

5、發(fā)熱伴病人血清細(xì)胞因子濃度與病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，從而為進(jìn)一步深入了解SFTSV的致病機(jī)制提供線索和依據(jù)。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)SFTS病人血清某些細(xì)胞因子含量比健康人高，如TNF-α、G-CSF、IL-6、IL-10等。重癥病例血清G-CSF、IL-6、TNF-α、IL-10等細(xì)胞因子含量顯著高于輕癥病例。死亡病例血清細(xì)胞因子G-CSF、TNF-α含量顯著高于存活病例，這說明過度表達(dá)的細(xì)胞因子會(huì)影響疾病病情及轉(zhuǎn)歸。既往研究發(fā)現(xiàn)SF

6、TS病人血清細(xì)胞因子含量與體內(nèi)病毒載量呈正相關(guān)，我們懷疑細(xì)胞因子的過度表達(dá)會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)向調(diào)控，影響病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制和清除，進(jìn)而影響疾病病情。
　　作為一種新發(fā)傳染病，SFTSV發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，病毒的NSs蛋白可以與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路上的IRF3、TBK1相互作用，通過與這些信號(hào)分子的相互作用，將其“劫持”進(jìn)入病毒感染誘導(dǎo)形成的細(xì)胞胞質(zhì)囊泡中，使得這些信號(hào)分子功能受到抑制，影響Ⅰ型干擾素信號(hào)途徑

7、傳導(dǎo)。然而目前有關(guān)SFTSV對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究多局限于單一信號(hào)分子。病毒感染與機(jī)體防御之間的博弈是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，想要了解SFTSV的致病機(jī)制就需要對(duì)病毒調(diào)控Ⅰ型干擾素通路的過程有詳細(xì)全面的了解。此外，研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)熱伴病毒感染Vero細(xì)胞和HEK293細(xì)胞時(shí)，病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白能夠和核蛋白以及病毒RNA互相作用，這說明NSs蛋白可能參與了SFTSV的復(fù)制過程。既往研究證實(shí)，用黃熱病毒NS1蛋白免疫恒河猴后再接種致死劑量病毒時(shí)，

8、可顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率。接種日本森林腦炎病毒NS1 DNA疫苗可有效的降低該病毒感染導(dǎo)致的小鼠死亡率。雖然已有研究證實(shí)用重組的NSs蛋白免疫小鼠并不能有效的清除小鼠體內(nèi)的SFTSV，但鑒于原核表達(dá)的重組蛋白僅保留了線性表位，本研究旨在用NSs蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，檢測其對(duì)病毒的清除作用，以評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠潛在的保護(hù)能力。
　　研究目的:
　　1、檢測SFTS病人急性期血清中細(xì)胞因子含量，檢測細(xì)胞因子風(fēng)暴存在與否，分析細(xì)胞

9、因子含量與疾病病情的關(guān)系。
　　2、通過建立乳鼠的發(fā)熱伴病毒感染模型，分析各類細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體內(nèi)SFTSV復(fù)制和清除的影響，為深入研究SFTSV的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　3、通過建立小鼠感染SFTSV模型，分析病毒感染后Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)譜的改變，為全面探討SFTSV的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　4、構(gòu)建SFTSV NSs蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒并評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠潛在的保護(hù)能力。
　　研究方法:
　　1、

10、采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)檢測SFTS病例組和健康對(duì)照組人群血清中細(xì)胞因子含量。按照病例組VS對(duì)照組，重癥病例VS輕癥病例的分組方式，分析各組人口特征（性別、年齡）及細(xì)胞因子含量的差異。
　　2、建立BALB/c乳鼠感染SFTSV的動(dòng)物模型，腹腔注射不同劑量細(xì)胞因子，通過熒光定量PCR方法檢測乳鼠體內(nèi)病毒載量和抗病毒相關(guān)因子表達(dá)，組織切片染色查看組織損傷。
　　3、建立BALB/c小鼠感染SFTSV模型，運(yùn)用基因芯片檢測小

11、鼠Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)譜的改變。
　　4、構(gòu)建SFTSV NSs蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(PVAX-NSs)，以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠后腹腔接種病毒，采取熒光定量PCR的技術(shù)測定組織中病毒載量，采取ELISA法測量小鼠血清內(nèi)干擾素濃度，基因芯片檢測Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)。
　　5、統(tǒng)計(jì)分析方法:所有資料利用Microsoft Office Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入。數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0分析

12、軟件。正態(tài)分布定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式描述，兩樣本均數(shù)差異的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)差異比較采用方差分析:滿足方差齊性檢驗(yàn)時(shí)采用Bonferroni法，不滿足方差齊性檢驗(yàn)時(shí)采用Dunnett's T3法。非正態(tài)分布定量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）的形式描述，差異比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)-Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。定性資料采用構(gòu)成比形式描述，分析時(shí)采用卡方檢驗(yàn)。P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究

13、結(jié)果:
　　1、血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果
　　1.1.SFTS病例組與對(duì)照組的人口特征（性別、年齡）無差異(P＞0.05）。本研究共檢測10種細(xì)胞因子，分別為:TNF-α、IFN-γ、IFN-α、G-CSF、 IL-10、IL-6、RANTES、MIP-1α、IP-10及MCP-1。除RANTES外，病例組與健康對(duì)照組血清中各細(xì)胞因子含量均有差異，病例組血清內(nèi)各類細(xì)胞因子濃度均比健康對(duì)照組高(P＜0.05）。
　　1.2.

14、SFTS重癥病例組與輕癥病例組性別分布無差異，但重癥病例年齡顯著高于輕癥病例(P＜0.05)。重癥病例血清IFN-γ、 IFN-α、G-CSF、MIP-1α、IL-6和IP-10含量高于輕癥病例(P＜0.05）。
　　2、細(xì)胞因子對(duì)SFTSV復(fù)制和清除的影響
　　2.1.已感染SFTSV的BALB/c乳鼠腹腔注射細(xì)胞因子后，注射高劑量IFN-α的乳鼠體重明顯輕于對(duì)照組和低劑量組(P＜0.05）。
　　2.2.IFN-α

15、、MIP-1α或IFN-γ處理組乳鼠肝臟組織病毒載量比對(duì)照組高(P＜0.05）。
　　2.3.IFN-α、MIP-1α或IFN-γ處理組乳鼠脾臟組織病毒載量高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2.4.與對(duì)照組相比，IFN-α、MIP-1α或IFN-γ處理組乳鼠脾臟組織抗病毒相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變:除SOCS1外，IRF3、STAT1、NF-κB、CXCL10表達(dá)均有不同程度下降。
　　3、基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)病毒感染后機(jī)體Ⅰ型

16、干擾素信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變。其中CAV1、CD86、H2-BL、IFITM1、MAL、PRKCZ、TLR8、IFNB1、IFNA4等基因表達(dá)明顯下降;而IL10、EIF2AK2、IFIT1、IRF7、ISG15、OAS2、MX1等基因的表達(dá)顯著升高。
　　4、PVAX-NSs真核質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，可在一定程度上拮抗NSs對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的抑制，但未能有效清除小鼠體內(nèi)的病毒。
　　結(jié)論

17、:
　　1、通過比較SFTS病人和對(duì)照人群血清中細(xì)胞因子含量，證實(shí)了SFTSV感染可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴。通過分析不同病情SFTS病人血清中細(xì)胞因子含量，證實(shí)因子風(fēng)暴和SFTS病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示細(xì)胞因子風(fēng)暴可預(yù)測SFTS疾病進(jìn)程和預(yù)后情況。
　　2、通過乳鼠感染模型證實(shí)過量細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能負(fù)向調(diào)節(jié)，影響抗病毒基因的表達(dá)，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制和清除。
　　3、SFTSV病毒感染影響Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)

18、基因表達(dá)。
　　4、NSs真核表達(dá)載體免疫未能給BALB/c小鼠提供有效的保護(hù)。
　　意義和創(chuàng)新:
　　1、本研究證實(shí)SFTSV感染可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，發(fā)現(xiàn)SFTS病情與細(xì)胞因子風(fēng)暴有關(guān)，提示保持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)在改善疾病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸中十分關(guān)鍵。
　　2、現(xiàn)過量細(xì)胞因子會(huì)對(duì)機(jī)體SFTSV感染產(chǎn)生影響，為臨床治療和深入研究疾病發(fā)病機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。
　　3、首次通過表達(dá)譜基因芯片全面分析了SFTSV感染對(duì)