擬南芥CRY1基因C末端導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜的遺傳表達(dá)及卡那霉素抗性篩選方法研究.pdf

1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究中心從2003年起，利用floral-dip轉(zhuǎn)基因方法對(duì)甘藍(lán)型油菜(B.napus L.)westar及白菜型油菜(B.campestris L．)雅安黃油菜(雅黃)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了一批具有卡那霉素(Km)抗性的種子，本研究對(duì)這批種子進(jìn)行了遺傳、表達(dá)鑒定及Km抗性篩選方法的研究，主要結(jié)果如下： 1．對(duì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜westar后代T2代株系，通過(guò)Km抗性鑒定，結(jié)合PCR檢測(cè)及序列比對(duì)驗(yàn)證，對(duì)擬南芥CRY

2、1基因C末端導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜后的遺傳表現(xiàn)進(jìn)行了分析；并利用GUS染色和花色素苷積累量的比較，對(duì)CRY1基因C末端在轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化的外源目的基因多數(shù)以嵌合形式，少數(shù)以單拷貝形式整合到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的基因組中；目的基因能穩(wěn)定地遺傳給后代，株系間遺傳傳遞率為62．5％：T2代的遺傳行為少數(shù)呈現(xiàn)孟德?tīng)栠z傳，多數(shù)呈現(xiàn)非孟德?tīng)栠z傳現(xiàn)象；擬南芥CRY1基因能在轉(zhuǎn)基因油菜中表達(dá)，但也出現(xiàn)了沉默現(xiàn)象。 2．對(duì)轉(zhuǎn)

3、基因甘藍(lán)型油菜westar后代T<,3>代種子，利用近紅外檢測(cè)儀對(duì)種子的含油量、芥酸含量、硫苷含量等品質(zhì)性狀進(jìn)行檢測(cè)，方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因油菜種子在含油量、芥酸含量、硫苷含量等品質(zhì)性狀上與非轉(zhuǎn)基因油菜沒(méi)有顯著差異。 3．對(duì)雅安黃油菜T<,0>代種子，利用Km葉片涂抹法、種子浸泡法以及MS培養(yǎng)基法對(duì)含有NPT-II標(biāo)記基因的T<,0>代種子進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，三種篩選方法的最佳Km選擇壓都為200mg/L；涂抹葉片法4-5d可

4、以明顯識(shí)別植株對(duì)Km抗性與否，此法篩選到的4株植株P(guān)CR檢測(cè)全部呈陽(yáng)性，可靠性達(dá)100％；浸泡種子法2-3d可從長(zhǎng)出子葉是否是綠色明顯識(shí)別植株對(duì)Km抗性與否，此法篩選到的5株植株P(guān)CR檢測(cè)全部呈陽(yáng)性，可靠性100％；MS培養(yǎng)基篩選法一般10-15d可以明顯植株識(shí)別對(duì)Km抗性與否，此法篩選到20株植株，移栽后存活5株，PCR檢測(cè)3株呈陽(yáng)性，2株是假陽(yáng)性植株，可靠性為60％。因此可以認(rèn)為葉片涂抹和種子浸泡兩種方法是油菜轉(zhuǎn)基因進(jìn)行大規(guī)模、快速