槐角異黃酮生物轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物抗乳腺癌細胞活性研究.pdf

1、槐角富含糖苷型異黃酮，利用具有豐富水解酶系的食藥用真菌進行槐角異黃酮生物轉(zhuǎn)化有可能提升異黃酮的生物活性，但該方面研究少見報道。鑒于此，本論文從槐角生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選、槐角生物轉(zhuǎn)化主要產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析及生物轉(zhuǎn)化工藝、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物——染料木素溶解度的測定及關(guān)聯(lián)以及槐角發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對乳腺癌細胞增殖及凋亡的研究等方面重點研究了槐角異黃酮食藥用真菌生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗乳腺癌活性，旨在為槐角異黃酮的生物轉(zhuǎn)化及抗乳腺癌藥物的發(fā)現(xiàn)提供理論及技術(shù)基礎。獲得的主

2、要結(jié)果如下：
　　 通過平板透明圈法借助創(chuàng)新性的菌株布局圖分析對30個屬61株食藥用真菌的槐角生物轉(zhuǎn)化菌株進行初篩得到18株菌株；通過固體和液體篩選培養(yǎng)基中β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶復篩出菌株DS1和N3，之后在槐角液體培養(yǎng)基中通過對β-葡萄糖苷酶活及槐角轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析，獲得槐角異黃酮有效生物轉(zhuǎn)化菌株——裂褶菌DS1（Schizophyllum commune DS1）。
　　 分別從槐角裂褶菌生物轉(zhuǎn)化2d和16d的轉(zhuǎn)化液中分離

3、純化出純度達95％的兩種化合物，經(jīng)LC-MS和NMR結(jié)構(gòu)鑒定分別為染料木素和異櫻黃素，染料木素和異櫻黃素裂褶菌生物轉(zhuǎn)化均為首次報道，其中異櫻黃素的生物轉(zhuǎn)化填補了國內(nèi)外異櫻黃素生物轉(zhuǎn)化的研究空白。
　　 對槐角染料木素裂褶菌生物轉(zhuǎn)化進行了研究。酶法轉(zhuǎn)化研究結(jié)果顯示：通過分離純化獲得了純度較高的β-葡萄糖苷酶，其酶學性質(zhì)為：分子量約為43.4kDa，在50℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，最適溫度為50℃，最適pH為5～6，以pNPG為底物

4、測得酶反應動力學參數(shù)Km＝9.43 mmol/L，Vmax＝3.39 mmol/(L.min)；裂褶菌粗酶液酶解槐角浸膏優(yōu)化工藝為：酶用量0.3U，酶解4 h，酶解溫度50℃，酶解初始pH 5.0，Ca2+濃度30 mmol/L，槐角浸膏濃度80 g/L，染料木素轉(zhuǎn)化率達到（8.68±0.65）％（g/g）?；苯侨玖夏舅亓疡蘧l(fā)酵轉(zhuǎn)化優(yōu)化工藝為：種齡3d、二級發(fā)酵、pH自然，接種量9％、槐角底物濃度5％、轉(zhuǎn)化時間2d，染料木素轉(zhuǎn)化率達到

5、3.5mmol/L，并對染料木素發(fā)酵轉(zhuǎn)化動力學模型進行了研究，其動力學模型為：
　　
　　 進一步明晰了槐角染料木素裂褶菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化的主要轉(zhuǎn)化途徑：槐角苷中4′-葡糖苷被水解產(chǎn)生染料木素，在轉(zhuǎn)化體系中79％染料木素的產(chǎn)生來源于槐角苷的水解。
　　 對槐角異櫻黃素裂褶菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化進行了初步研究。明晰了槐角裂褶菌轉(zhuǎn)化體系中異櫻黃素的主要轉(zhuǎn)化途徑：槐角苷水解形成染料木素，染料木素5-OH甲氧基化形成異櫻黃素。在優(yōu)化后的異

6、櫻黃素發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件下，發(fā)酵12d，異櫻黃素含量達到3.4mmol/L，其轉(zhuǎn)化動力學模型為：。
　　 利用Apelblat方程模型對染料木素在水、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙酸乙脂中的溶解度進行了測定及關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)Apelblat方程模型能較好的擬和溶解度實際數(shù)據(jù)并確定甲醇為提取染料木素溶劑。進一步利用經(jīng)驗模型對染料木素在不同甲醇溶劑體系中的溶解度進行了測定和關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)驗模型能較好的擬和染料木素在不同甲醇溶劑體系中的溶解度，依據(jù)

7、該溶解度數(shù)據(jù)，確定槐角轉(zhuǎn)化液中染料木素提取溶劑為75％終濃度的甲醇溶液。
　　 槐角發(fā)酵轉(zhuǎn)化物對乳腺癌細胞增殖及凋亡的研究結(jié)果表明：槐角經(jīng)裂褶菌轉(zhuǎn)化后對人乳腺癌MCF-7（ER+）細胞抑制增殖作用增強，其抑制增殖活性物質(zhì)主要存在于乙醇提取液中；轉(zhuǎn)化主要產(chǎn)物染料木素和異櫻黃素對MCF-7細胞的抗增殖影響均具有較好的劑量和時效相關(guān)性；在低劑量和高劑量下，異櫻黃素抑制MCF-7細胞增殖活性強于染料木素，在10 μmol/L下二者對MC