腺病毒介導(dǎo)的LIGHT聯(lián)合白細胞介素12治療小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌及其免疫機理研究.pdf

1、乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率僅次于肺癌。 利用具有抗腫瘤作用的細胞因子進行基因治療在很多動物模型中取得了較好的抗腫瘤效果。實驗證實，白細胞介素(IL-12，IL-2)，IFN-γ，GM-CSF等細胞因子可以通過增強T淋巴細胞免疫功能作用而清除腫瘤。 白細胞介素12(IL-12)是天然免疫和獲得性免疫中重要的細胞因子，具有抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能。它是由p35和p40兩個亞基組成的二聚體，主

2、要由巨噬細胞，樹突狀細胞，中性粒細胞等分泌。IL-12能夠誘導(dǎo)T淋巴細胞和NK細胞的增殖活化，增強它們的細胞毒性并促進Th1型細胞因子特別是IFN-γ的分泌，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。 單獨應(yīng)用一些具有抗腫瘤作用的細胞因子如IL-12，GM-CSF等進行基因治療雖然能有效地誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)，但它們的效果比較局限，一般只能在一定程度上局部抑制腫瘤的生長，對于已經(jīng)惡性生長的腫瘤，特別是具有高轉(zhuǎn)移特性的惡性腫瘤，這種單獨細胞因子基因療法很難達到理

3、想的效果。選擇相互間有協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用的細胞因子，進行聯(lián)合基因治療，是腫瘤細胞因子基因治療的一個發(fā)展方向。 來源于BALB/c小鼠的4T1乳腺癌細胞與人類的乳腺癌細胞比較接近，具有低免疫原性和高轉(zhuǎn)移性，可轉(zhuǎn)移到肺，肝，淋巴結(jié)，骨髓及神經(jīng)系統(tǒng)。嚴(yán)重的肺轉(zhuǎn)移通常是導(dǎo)致荷瘤小鼠死亡的主要原因。當(dāng)腫瘤形成時，外科摘除腫瘤并不能顯著減小肺部轉(zhuǎn)移的危險性，因此，這種腫瘤模型適合抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因治療方面的研究。 本文的主要目

4、的在于研究腺病毒介導(dǎo)的LIGHT聯(lián)合IL-12的抗腫瘤作用及其免疫機理探討，觀察其對小鼠4T1乳癌和轉(zhuǎn)移的治療作用以及長期免疫保護作用。我們建立了BALB/c小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌4T1模型，應(yīng)用LIGHT(AdLIGHT)聯(lián)合IL-12(AdIL-12)的重組腺病毒進行瘤內(nèi)注射取得了顯著的抗腫瘤治療效果。實驗證實，與單獨的AdLIGHT或AdIL-12治療相比，聯(lián)合兩種分子，誘發(fā)機體產(chǎn)生了更強的特異性和非特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，荷瘤小鼠腫瘤的

5、生長受到了抑制并最終消退，日誘發(fā)了長期的免疫保護反應(yīng)。此外，這種聯(lián)合療法還抑制了腫瘤細胞的肺和肝轉(zhuǎn)移，顯著提高了小鼠的生存率并延長了生存時間，提示聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12可能在基因治療轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤方面具有潛在的應(yīng)用價值。 本研究分為體外和體內(nèi)實驗兩部分： 第一部分：LIGHT和IL-12的重組腺病毒對4T1細胞的感染及其生物學(xué)活性的鑒定 我們首先用重組腺病毒AdLIGHT，AdIL-12及對照病毒A

6、dLacZ感染4T1細胞，應(yīng)用RT-PCR檢測了LIGHT和IL-12(IL-12p35，IL-12p40)在mRNA水平上的表達，用ELISA法和FACS檢測了LIGHT和IL-12在蛋白水平上的表達。結(jié)果顯示，腺病毒攜帶的LIGHT和IL-12能在4T1細胞中高效表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在抗小鼠CD3存在的情況下，感染了AdLIGHT或AdIL-12的4T1細胞能夠有效刺激T淋巴細胞的增殖并誘導(dǎo)IFN-γ的分泌，且AdLIGHT和Ad

7、IL-12具有協(xié)同刺激T淋巴細胞增殖的作用，說明，感染AdLIGHT或AdIL-12的4T1細胞所表達的IL-12或LIGHT具有生物學(xué)活性。此外，AdLIGHT和AdIL-12腺病毒還誘導(dǎo)了部分4T1細胞的凋亡。 第二部分：腺病毒介導(dǎo)的LIGHT聯(lián)合IL-12對小鼠4T1乳癌的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用及其免疫機理研究 收集對數(shù)生長期的4T1細胞，注射至BALB/c小鼠右腹部皮下，建立4T1高轉(zhuǎn)移乳腺癌模型，隨機分組后，分別瘤

8、內(nèi)注射腺病毒AdLIGHT,AdIL-12，AdLIGHT/IL-12進行治療，并設(shè)PBS和AdLacZ為對照組。 我們用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小并觀察荷瘤小鼠的生存期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS和AdLacZ對照組相比，單獨應(yīng)用AdLIGHT或AdIL-12進行治療，抑制了腫瘤的生長并延長了荷瘤小鼠的生存期，兩組分別有28.6％和42.9％的小鼠腫瘤消退并得到了長期存活(＞90天)。聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12進行治療，不僅顯著抑制

9、了腫瘤的生長，而且促進了腫瘤的消退，延長了小鼠的生存期。機制研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療增強了小鼠脾細胞的NK和CTL殺傷活性并誘導(dǎo)了更多的Th1細胞因子(IL-2，IFN-γ)的分泌。提示機體被有效誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 為了檢測聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療是否誘導(dǎo)了小鼠長遠性的保護性免疫力，我們將長期存活小鼠分為兩組，在左腹皮下分別接種4T1細胞或CT26腸癌細胞并同時以未經(jīng)任何處理的小鼠作為對照組，分

10、別皮下接種同數(shù)量的4T1細胞或CT26細胞，觀察每組小鼠成瘤比率和存活時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療誘發(fā)小鼠產(chǎn)生了針對4T1細胞的保護性免疫，同時也產(chǎn)生了對CT26細胞的部分保護作用。 炎性細胞對腫瘤的浸潤和腫瘤組織的壞死有利于機體對腫瘤的清除。腫瘤組織病理切片顯示，伴隨著瘤內(nèi)和瘤周炎性細胞(中性粒細胞，淋巴細胞)中等程度的浸潤，AdLIGHT或AdIL-12單獨治療組腫瘤存在一定程度的壞死。在AdLIG

11、HT和AdIL-12聯(lián)合治療組，瘤周和瘤內(nèi)的炎性細胞浸潤最多，有大約2/3的腫瘤組織存在著嚴(yán)重的壞死。 我們進一步用半定量PCR的方法檢測了腫瘤組織中趨化因子CCL21，IP-10，Mig的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL21可表達在AdLIGHT或AdLIGHT/IL-12治療組的腫瘤組織，而在對照組和AdIL-12治療組則不表達，說明瘤內(nèi)注射AdLIGHT誘導(dǎo)了CCL21的表達。IP-10和Mig可表達在AdLIGHT或AdIL-

12、12單獨治療組，但它們在聯(lián)合治療組的表達量最高，提示聯(lián)合應(yīng)用AdLIGHT和AdIL-12，可能通過誘導(dǎo)腫瘤組織表達更多的IP-10和Mig，從而發(fā)揮趨化T淋巴細胞和抑制腫瘤血管形成的抗腫瘤作用。 4T1乳腺癌具有很高的全身轉(zhuǎn)移特性，特別對肺組織的轉(zhuǎn)移，通常是導(dǎo)致荷瘤小鼠死亡的主要原因。我們首先用腫瘤細胞集落形成實驗檢測各組荷瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移情況，將肺組織制成細胞懸液，加入6-巰鳥嘌呤培養(yǎng)10到12天后，對6-巰鳥嘌呤不敏感的4T

13、1細胞可以繼續(xù)生長并形成細胞集落，而其他細胞則在6-巰鳥嘌呤的作用下死亡，甲醇固定細胞后用0.03％亞甲基藍染色，顯微鏡下可計算各組轉(zhuǎn)移到肺組織的4T1細胞克隆形成數(shù)。結(jié)果顯示，在PBS和AdLacZ對照組，有大量4T1細胞克隆集落形成，而AdLIGHT或AdIL-12單獨治療組形成的克隆集落明顯減少，在聯(lián)合治療組未檢測到細胞克隆的形成。提示聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12進行治療，抑制了乳腺癌細胞對肺組織的轉(zhuǎn)移。肺組織的印度墨水染色

14、和病理切片分析進一步證實了以上結(jié)論。 我們在T細胞缺陷的BALB/c裸鼠中觀察了AdLIGHT/IL-12對4T1乳腺癌的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未治療組相比，AdLIGHT/IL-12只在一定程度上抑制了腫瘤的生長，但不能促進腫瘤的消退。缺少T淋巴細胞，顯著降低了AdLIGHT/IL-12的抗腫瘤作用。提示T淋巴細胞在AdLIGHT/IL-12抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。我們進一步用NK細胞剔除實驗證實，在AdLIGHT/IL

15、-12治療4T1乳腺癌模型中，NK細胞也是發(fā)揮重要作用的效應(yīng)細胞。 結(jié)論：1.腺病毒介導(dǎo)的LIGHT和IL-12基因能在4T1乳腺癌細胞中高效表達，表達的LIGHT和IL-12具有刺激T淋巴細胞增殖并誘導(dǎo)IFN-γ分泌的能力。 2.在小鼠4T1乳腺癌模型中，聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12進行瘤內(nèi)注射治療，顯著抑制了腫瘤的生長并最終促進其消退，接受聯(lián)合治療的小鼠可以長期存活。3.聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療有

16、效抑制了腫瘤的肺和肝轉(zhuǎn)移。 4.AdLIGHT和AdIL-12聯(lián)合治療誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了針對4T1乳腺癌的長遠性保護性免疫，同時也誘導(dǎo)出了針對CT26腸癌細胞的部分保護性免疫。 5.聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療增強了小鼠脾細胞的NK和CTL殺傷活性并誘導(dǎo)了更多的Th1細胞因子(IL-2，IFN-γ)的分泌，誘導(dǎo)機能產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。T淋巴細胞和NK細胞是AdLIGHT/IL-12抗腫瘤效應(yīng)中的