糜酶基因CMA-B多態(tài)性與2型糖尿病腎病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、本研究應(yīng)用分子遺傳學(xué)技術(shù)，測定浙江地區(qū)漢族正常人、糖尿病腎病患者CMA基因CMA多態(tài)性的頻率，探討CMA基因CMA/B多態(tài)性在漢族人群糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。為糖尿病腎病的病因研究探索新的途經(jīng)，為糖尿病腎病的防治提供依據(jù)。 研究對象：2型糖尿病患者130例，病例選自浙江省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科病房(2002年8月至2003年9月)。病例符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷和分型標準，并采用Mogensen糖尿病腎病分期標

2、準進行分組：根據(jù)尿白蛋白排泄率(UAER)將糖尿病患者分為三組：正常蛋白尿組(NA，UAER＜20μg/min)66例(男34例、女32例)，年齡(57.1±12.1)歲；微量白蛋白尿組(MA，UAER20～200μg/min)40例(男19例、女21例)，年齡(59.4±11.5)歲；臨床蛋白尿組(CP，UAER＞200μg/min或尿蛋白＞500mg/24h)24例(男13例、女11例)，年齡(65.9±13.6)歲。排除原發(fā)腎臟疾

3、病、泌尿系感染、糖尿病酮癥酸中毒、心力衰竭的影響，用兩次UAER均增高者測定其平均值來判斷糖尿病腎病的病變程度。 正常對照組(NC)145例選自浙江地區(qū)漢族人群健康體檢的隨機個體，其中男性80例，女性65例，年齡(59.4±9.7)歲。經(jīng)詳細的病史詢問、體格檢查及胸片、心電圖、肝膽B(tài)超、血尿糞常規(guī)、血生化檢查均未見異常，并除外有心血管或糖尿病或腎病史。本研究對象之間無血緣關(guān)系，均為漢族人。 基因組DNA抽提和CMA基因多

4、態(tài)性檢測： 1.白細胞基因組DNA提取：以酚\氯仿抽提法提取外周血白細胞DNA。 2.CMA基因CMA/B多態(tài)性的檢測應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測。引物列為：P1.5'-GGAAATGTGAGCAGATAGTGCAGTC-3’；P2.5'-AATCCGGAGCTGGAGAACTCTTGTC-3’；PCR反應(yīng)體系為25μl，模板DNA100ng，引物1和2各10pmol，10×TaqDNApolymerasebuffer(

5、withoutMg2+)2.5μl，10mMMgCl22μl，10mMdNTP0.5μl，TaqDNApolymerase(5u/μL)0.15μl。 在PCR熱循環(huán)儀(GeneAmpPCRsystem2400，PerkinElmer)上擴增，95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，共39個循環(huán)。PCR產(chǎn)物以2％凝膠電泳(含溴乙錠0.5μg/ml)，經(jīng)100V30分鐘，在紫外光下觀察，攝影。PC

6、R產(chǎn)物放置4℃?zhèn)溆?。取PCR產(chǎn)物2μl，BstⅪ酶3U，10×buffer1μ1，滅菌去離子水6μl；反應(yīng)總體積10μl。在55℃酶切3小時，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下檢測。 PCR擴增產(chǎn)物為285bp的片段。G型含酶切位點經(jīng)BstⅪ水解為195bp、90bp2條片斷；A型不含酶切位點不能被水解。酶切產(chǎn)物：僅1條285bp帶為AA型；有195bp、90bp2條帶為GG型；有285bp、195bp、90bp3條帶

7、，為AG型。 統(tǒng)計分析資料輸入數(shù)據(jù)庫： 應(yīng)用SPSS10.0軟件包作統(tǒng)計學(xué)處理。用基因計數(shù)方法計算各組病例和正常人的基因型和等位基因頻率。用Hardy-Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性，各組基因型和等位基因頻率差異比較用χ2檢驗。連續(xù)變量的比較用t檢驗和單因素方差分析。危險因素分析采用Logistic回歸。所有結(jié)果P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： 研究對象的Hardy-Weinberg

8、平衡檢驗中國漢族研究對象符合Hardy-Weinberg平衡，CMA基因AA、AG、GG基因型頻率觀察數(shù)與期望數(shù)無顯著差異。其中正常人CMA基因型χ2值為0.120，P＞0.05；糖尿病患者CMA基因型χ2值為2.020，P＞0.05。 浙江地區(qū)中國漢族人CMA基因CMA/B多態(tài)性分布在中國漢族正常人中，CMAAA、AG、GG基因型頻率分別為0.16、0.50和0.34，A、G等位基因頻率分別為0.41和0.59。 糖尿

9、病正常蛋白尿組中，CMAAA、AG、GG基因型頻率分別為0.20、0.55和0.26，A、G等位基因頻率分別為0.47和0.53。 糖尿病微量白蛋白尿組中，CMAAA、AG、GG基因型頻率分別為0.13、0.53和0.35，A、G等位基因頻率分別為0.39和0.61。 糖尿病臨床蛋白尿組中，CMAAA、AG、GG基因型頻率分別為0.13、0.63和0.25，A、G等位基因頻率分別為0.44和0.56。 正常人與糖

10、尿病腎病各組CMA基因CMA/B多態(tài)性的比較糖尿病各組CMA基因CMA/B基因型和等位基因頻率與正常對照組相比無顯著差異(基因型；χ2=3.359；等位基因頻率A與G：χ2=1.940，P均＞0.05)。糖尿病組與正常對照組相比無顯著差異(基因型：χ2=1.219；等位基因：χ2=0.560，P均＞0.05)。 糖尿病腎病組與非腎病組相比無顯著差異(基因型：χ2=1.403；等位基因：χ2=1.062，P均＞0.05)。

11、 遲發(fā)/未發(fā)DN組(病程≥10年且仍為正常白蛋白尿者)與早發(fā)DN組(病程≤5年且已為異常白蛋白尿)相比無顯著差異(基因型：χ2=4.092；等位基因：χ2=3.420，P均＞0.05)。 糖尿病組患者危險因子分析： 1.比較糖尿病腎病不同階段的臨床生化指標，年齡(F=4.536，P=0.013)、病程(F=3.431，P=0.035)、收縮壓(F=10.800，P=0.000)、空腹胰島素(F=3.351，P=0.041

12、)以及血纖維蛋白原(F=3.122，P=0.048)在各組之間有顯著差異，提示在本研究組中，這些因素可能與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 2.針對是否發(fā)生糖尿病腎病進行Logistic回歸檢驗，進入自變量的是單因素分析有統(tǒng)計學(xué)差異的因素：年齡、病程、收縮壓、空腹胰島素以及血纖維蛋白原。結(jié)果為病程(Wald值=8.3005，P=0.0040)及收縮壓(Wald值=4.1691，P=0.0412)有統(tǒng)計學(xué)差異，其對應(yīng)的回歸系數(shù)分別是0.

13、2096和0.0372。 CMA基因CMA/B多態(tài)性與糖尿病腎病危險因子的關(guān)系： 1.糖尿病病人CMA基因型與糖尿病腎病危險因子比較，可見CMA基因型分布與糖尿病患者的年齡、體重指數(shù)、血壓、甘油三脂、高密度脂蛋白、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA指數(shù)、糖化血紅蛋白、尿酸、纖維蛋白原、病程以及性別、肥胖、高血壓病(HT)、高脂血癥、吸煙、家族史間差異均無顯著性(P均＞0.05)，除了總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C

14、)。 2.不同基因組之間兩兩比較結(jié)果： (1)GG組的TC為5.15±1.35mmol/L顯著高于AG組的4.46±1.12mmol/L(t=-2.840，P＜0.01)； (2)GG組LDL-C為2.73±0.65mmol/L顯著高于AG組的2.33±0.63mmol/L(t-3.036，P＜0.01)。 研究結(jié)論： 1、浙江地區(qū)漢族人群存在糜酶CMA基因CMA/B多態(tài)性。 2、CMA基