TRP通道阻斷劑鑭對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、干細(xì)胞是指能夠相對(duì)無限或較長(zhǎng)時(shí)間自我更新的細(xì)胞，并且新復(fù)制的細(xì)胞可以分化成一種以上的功能細(xì)胞系。而神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSC)則是指能夠自我復(fù)制和具有神經(jīng)定向分化能力的細(xì)胞。自然的NSC分裂分化活動(dòng)受到多種因素的調(diào)節(jié)，主要分為內(nèi)因和外因兩方面。內(nèi)因主要是影響細(xì)胞周期和各種細(xì)胞周期因子，諸如Notch信號(hào)、Math基因家族、gp130/JAK/stat3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)途徑等，外因受細(xì)胞因子和微環(huán)境的影響。目前，

2、對(duì)NSC分化研究側(cè)重于細(xì)胞因子及內(nèi)環(huán)境信號(hào)的作用。不同種類的細(xì)胞因子、同一細(xì)胞因子不同濃度以及多種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NSC誘導(dǎo)分化作用各不相同，且不同階段，相同細(xì)胞因子的作用亦不同。 研究表明鈣通道在神經(jīng)發(fā)育過程中具有重要作用，例如：神經(jīng)錐生長(zhǎng)、神經(jīng)元的遷移、軸突和樹突的延伸、突觸可塑性等。Gage等在培養(yǎng)的胚胎E16天的海馬前體細(xì)胞上記錄到了電壓依賴性鈣電流，并且有報(bào)道電壓依賴性鈣通道參與了胚胎海馬神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化的調(diào)

3、控。 近年來，大量的研究表明，TRP通道作為一類新發(fā)現(xiàn)的Ca2+攝入途徑，在調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+平衡，傳遞胞外信號(hào)方面發(fā)揮重要作用。最近，多個(gè)工作證明TRP通道介導(dǎo)了神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的轉(zhuǎn)向。Greka等報(bào)道，TRPC5可以調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)突起的長(zhǎng)度及生長(zhǎng)錐的形態(tài)。Bezzerides等報(bào)道，在海馬神經(jīng)元中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子等可以誘導(dǎo)TRPC5快速轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，并影響神經(jīng)突起的延伸。2005年，蒲慕明實(shí)驗(yàn)室報(bào)道TRP通道的激活，使得鈣離子濃度升

4、高，引起netrin-1和BDNF介導(dǎo)的生長(zhǎng)錐的轉(zhuǎn)向。很顯然，隨著研究的深入，更多的TRP通道在發(fā)育中的重要作用將被揭示出來。 本研究的目的主要是建立并純化胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，并觀察TRP通道阻斷劑鑭、SKF96365對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響，探討TRP通道在調(diào)控胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分裂分化中的作用。 本實(shí)驗(yàn)分離孕鼠大腦半球，制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，利用無血清培養(yǎng)技術(shù)，在添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b

5、FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、B27supplement的DMEM/F12培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，連續(xù)傳代。培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，球體透亮，邊緣整齊，細(xì)胞排列緊密。在位于球邊緣的細(xì)胞膜上，還可見到睫毛狀小突起，隨著培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞球漸變大。和一般的細(xì)胞相比，神經(jīng)干細(xì)胞具有細(xì)胞核相對(duì)較大，胞漿少的特點(diǎn)。分別取原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞做免疫熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)均有細(xì)胞表達(dá)巢蛋白(nestin)抗原，傳至第三代細(xì)胞nestin陽性率可達(dá)99％。我們觀察了3-

6、5代的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)及增殖速率上沒有明顯的變化，以下實(shí)驗(yàn)均取用3-5代的細(xì)胞。 在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5umol/L的BrdU，作用2小時(shí)，免疫熒光雙標(biāo)BrdU與nestin發(fā)現(xiàn)細(xì)胞共表達(dá)這兩種抗原，說明細(xì)胞處于活躍的分裂增殖期。 將干細(xì)胞培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。分化2天后，鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)出突起，已初步具有神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞免疫熒光分別呈DCX和S-100β陽性。Doublecortin(DCX)是未成熟

7、神經(jīng)元的標(biāo)志物，它位于細(xì)胞體的周邊部，與微管重疊。S-100β是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的鈣活性蛋白質(zhì)。細(xì)胞克隆球來自神經(jīng)系統(tǒng)，可分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞；能自我復(fù)制，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。 MTT檢測(cè)結(jié)果：分別加入不同濃度的TRP通道阻斷劑LaCl3和SKF96365處理細(xì)胞。其OD值分別為control組的81.39％、75.56％、61.01％及87.76％、83.95％、74.93％，呈濃度依賴性降低。免疫熒光DAPI

8、染色及流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)顯示，LaCl3不引起細(xì)胞死亡，免疫熒光DAPI染色也證實(shí)SKF96365不引起細(xì)胞死亡。結(jié)果表明LaCl3和SKF96365對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量有影響，可降低胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量。 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果：把單細(xì)胞懸液接種于經(jīng)PLL包被的培養(yǎng)板上，加入5umol/L的BrdU2小時(shí)后，加入不同濃度LaCl3處理30分鐘，通過免疫細(xì)胞化學(xué)計(jì)數(shù)BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量。25uMLa組、50uMLa組、100uMLa組

9、，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)分別為control組的62.99％、59.54％、44.83％，與control組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢奓aCl3可抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴性。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)表示細(xì)胞增殖活性，其計(jì)算公式為：PI％=(S+G2/M)÷(GO/GI+S+G2/M)×100％。通過計(jì)算得出control組其PI為50.40％，LaCl3處理組PI為36.20

10、％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明LaCl3可抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。 對(duì)細(xì)胞分化的影響：把單細(xì)胞懸液接種于經(jīng)PLL包被的培養(yǎng)板上，先加入5umol/L的BrdU2小時(shí)后，再加入不同濃度LaCl3，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記BrdU和DCX或BrdU和S-100β，分別計(jì)數(shù)BrdU、DCX及S-100β陽性細(xì)胞的數(shù)量。 LaCl3處理后BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量減少，DCX或S-100β陽性細(xì)胞數(shù)量增加。25uMLa組、5