結(jié)核菌PEPCK抗原所致的免疫反應機制探討.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis)是由結(jié)核桿菌(MycobacteriumtuberculosisM.tb)感染所致的對人類健康危害最大的慢性傳染病。世界上約有1/3的人感染了結(jié)核，每年約8百萬人發(fā)病，2百萬人死亡。結(jié)核病是發(fā)展中國家和發(fā)達國家的重要的公共衛(wèi)生問題。在我國，結(jié)核患病率在世界上占第二位。目前有結(jié)核病人450萬，其中傳染性病人150萬，現(xiàn)在每年新發(fā)145萬，死亡數(shù)13萬，農(nóng)村占80％。如不防治，在今后10年，每年將新發(fā)200

2、0-3000萬。另外，多種藥物抗性結(jié)核菌株出現(xiàn)，在上海起始耐藥菌達35.2％，四川達47.8％，各省續(xù)發(fā)耐藥率達60-80％，結(jié)核問題日益嚴重。再加上此病易伴發(fā)HIV感染，對人類的威脅更加嚴重，因此，控制結(jié)核病的流行實在必需。 疫苗是控制傳染病流行最有效和最經(jīng)濟的手段?，F(xiàn)在使用的預防結(jié)核的疫苗是卡介苗(BacilleCalmette-GuerinBCG)，由減毒的活牛結(jié)核桿菌制成。調(diào)查發(fā)現(xiàn)BCG對肺結(jié)核的保護作用很不穩(wěn)定，它是現(xiàn)

3、在所用的疫苗中最有爭議者之一。英國報導BCG的兒童發(fā)病保護率為77％，印度報導成人發(fā)病保護率為零。另外，由于BCG是減毒活菌，本身有致病和毒力恢復的潛能，對免疫力低下的個體尤其如此。所以，WHO建議AIDS病人不能用BCG。鑒于BCG的這些缺點，急需尋找抗結(jié)核的其他疫苗。 一般認為，病原菌的致病物質(zhì)，與生存以及誘導機體免疫反應有關(guān)的成分是疫苗最佳候選分子。結(jié)核桿菌感染所致的損傷主要是以結(jié)核結(jié)節(jié)為特征的免疫病理變化。原發(fā)感染時，細

4、菌在肺部緩慢繁殖，引起輕微炎癥。4-8周后，波及局部淋巴結(jié)，CD4+T細胞被激活，產(chǎn)生γ-干擾素(InterferongammaIFN-γ)，活化巨噬細胞，以殺傷結(jié)核桿菌。T細胞的持續(xù)活化導致結(jié)核肉芽腫的形成。因此，可激活T細胞而引起結(jié)核結(jié)節(jié)形成的成分被認為是極好的疫苗候選分子。 結(jié)核肉芽腫包繞著結(jié)核桿菌，防止其擴散，同時也阻止宿主殺傷因子的進入。在結(jié)節(jié)內(nèi)由于壞死造成浸潤的巨噬細胞死亡，形成缺氧環(huán)境。結(jié)核桿菌在此環(huán)境中存活，主要

5、靠脂肪酸代謝提供碳源。因此，結(jié)核桿菌中參與脂肪酸代謝的酶可作為疫苗候選分子。 研究表明，致病性結(jié)核桿菌氧化脂肪酸的能力與它們在宿主體內(nèi)的生存能力有關(guān)。乙醛酸旁路中異檸檬酸裂解酶的編碼基因icl突變后可以降低結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的持續(xù)生長。乙醛酸旁路是結(jié)核桿菌脂肪酸代謝的唯一通路，草酰乙酸(Oxaloacetate“OAA”)是乙醛酸旁路的下游產(chǎn)物。磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvatecarboxyk

6、insse“PEPCK”)催化草酰乙酸脫羧向磷酸烯醇型丙酮酸(Phosphoenolpyruvate“PEP”)的轉(zhuǎn)化，如果PEPCK的功能喪失會使OAA聚集，進而影響乙醛酸旁路，導致脂肪酸代謝受阻。美國康乃爾大學的一項研究發(fā)現(xiàn)，如果將牛結(jié)核分枝桿菌BCG中乙醛酸旁路下游的編碼磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)的pckA基因從基因組中敲除，pckA基因變異的BCG與野生型BCG相比，在巨噬細胞內(nèi)的生存能力降低，易于被殺滅。所以，PEP

7、CK作為抗結(jié)核疫苗候選分子具有極大的潛力。為了進一步了解結(jié)核桿菌PEPCK是否為結(jié)核桿菌所必需的成分及其引起的免疫反應機制，本實驗研究了敲除了pckA基因的BCG的致病能力，引起機體的免疫反應的變化；應用分子生物學的方法表達、純化了重組融合蛋白PEPCK，并進行了鑒定；同時應用重組的PEPCK免疫小鼠，通過對淋巴細胞及其活性、細胞因子等免疫指標的檢測，鑒定了其免疫原性和抗原性，并初步研究了它對小鼠的保護作用；本研究還將PEPCK用于檢測

8、結(jié)核病人血清，鑒定了其診斷價值。 本研究完成的主要工作及取得的實驗結(jié)果： 1.敲除pckA基因的BCG引起的病理變化及引起機體免疫反應的檢測：用BCG-WT和BCG△pckA分別感染BALB/C小鼠，對小鼠的肺臟、脾臟和肝臟進行組織學檢查，發(fā)現(xiàn)pckA基因變異的BCG株感染的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)核結(jié)節(jié)比BCG野生型的結(jié)核結(jié)節(jié)數(shù)量少，感染度輕，結(jié)節(jié)不典型；通過對小鼠T細胞和細胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)用BCG-WT感染的小鼠脾臟CD4+

9、T淋巴細胞和CD4+/CD8+均高于用BCG△pckA感染的小鼠(P＜0.05)，而且BCG-WT感染的小鼠脾細胞產(chǎn)生的細胞因子如IFN-γ、IL-12、TNF-α也明顯高于BCG△pckA感染的小鼠。 2.重組融合蛋白PEPCK的表達：根據(jù)結(jié)核分枝桿菌pckA基因開放讀碼框架設(shè)計引物5'-CGCCATATGACCTCAGCGACCATCCC-3'和5，-CGCCTCGAGCTAACCTAGGCGCTCCT-3'。用此引物對結(jié)核

10、桿菌H37Rv染色體DNA進行PCR擴增，用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，把PCR擴增產(chǎn)物克隆到以pET為基礎(chǔ)的質(zhì)粒p6HisF-11d中的T7啟動子下游。建成pHF/pckA質(zhì)粒。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HB101大腸桿菌，表達出重組融合蛋白PEPCK。SDS-PAGE分析顯示，表達的重組蛋白為72KDa，與理論預測的PEPCK分子量大小一致。 3.重組PEPCK的純化、復性及鑒定：用親和層析的方法將表達的重組PEPCK純化，并進行濃縮、復性

11、。Westernblot分析顯示，表達的重組蛋白能夠被小鼠抗野生型BCG血清識別，表明pckA基因在體外表達的PEPCK與結(jié)核桿菌自然的PEPCK結(jié)構(gòu)一致，并具有反應活性。 4.免疫小鼠：用表達的重組融合蛋白PEPCK免疫BALB/C小鼠，每隔兩周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫兩周后，殺死部分小鼠，取其脾臟觀察，可見實驗組小鼠脾臟明顯增大并粘連；取脾臟淋巴細胞用流式細胞儀檢測小鼠T細胞，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠的CD4+T淋巴細胞和CD

12、4+/CD8+均高于用對照組；用ELISA法檢測小鼠血清中的細胞因子IFN-γ、IL-12、TNF-α，結(jié)果顯示實驗組小鼠的IFN-γ、IL-12、TNF-α明顯高于對照組(P＜0.05)；小鼠血清抗體檢測發(fā)現(xiàn)，血清抗PEPCK抗體滴度可達到1∶1280甚至以上。用MTT法進行淋巴細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠淋巴細胞的刺激指數(shù)(SI)明顯高于對照組，表明實驗組小鼠的淋巴細胞活性明顯增高。 5.用PEPCK第三次免疫小鼠兩周后，用B

13、CG-WT感染各組小鼠，每只小鼠感染的菌量為1×106個細菌。感染后在不同的時點殺死小鼠，取其脾臟，研碎，取上清鋪于固體MB培養(yǎng)基，計數(shù)產(chǎn)生的菌落數(shù)量。結(jié)果顯示，PEPCK免疫組產(chǎn)生的菌落數(shù)量明顯少于佐劑組，這表明PEPCK能夠有效的刺激機體產(chǎn)生免疫反應，可以有效的抵御結(jié)核桿菌感染或降低感染程度，對機體產(chǎn)生保護作用。 6.用重組PEPCK檢測結(jié)核病人血清中抗PEPCK抗體，研究了PEPCK對于結(jié)核病的血清學診斷價值：到結(jié)核病醫(yī)院