骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合基質(zhì)膠修復(fù)大鼠腦損傷及動(dòng)態(tài)MEMRI成像大鼠視皮層實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著社會(huì)的不斷發(fā)展,交通設(shè)施更為發(fā)達(dá),機(jī)動(dòng)車輛增多,施工工地和工廠多,所導(dǎo)致的交通事故和工傷相應(yīng)增加,創(chuàng)傷傷員逐年增多。在這些創(chuàng)傷中,顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)的發(fā)生率較高,并且是創(chuàng)傷致死因?yàn)橹械氖滓蛩?在存活病例中,其致殘率也較高,給患者帶來(lái)極大的痛苦,也給社會(huì)和患者家人帶來(lái)負(fù)擔(dān)。盡管在顱腦損傷的院前救護(hù)、影像學(xué)技術(shù)、危重癥急救和康復(fù)鍛煉等臨床技術(shù)方面已經(jīng)有了顯著的進(jìn)步

2、,但治療的目的僅在于盡可能保存殘留的神經(jīng)功能,降低致死致殘率,而對(duì)于已經(jīng)發(fā)生的神經(jīng)損害尚無(wú)有效的治療手段。如何促進(jìn)顱腦損傷后神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。TBI后修復(fù)面臨的主要問(wèn)題是:原發(fā)性和繼發(fā)性的神經(jīng)元的缺失,以及受損部位周圍的局部微環(huán)境存在一些不利于軸突再生的因素,主要有髓鞘相關(guān)軸突生長(zhǎng)抑制因子(Nogo-A、MAG、Omgp等)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)改變、膠質(zhì)瘢痕的形成等,因此治療腦損傷的策略之一在于補(bǔ)

3、充缺失的神經(jīng)元,改善損傷局部的微環(huán)境。雖然大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明,無(wú)論是在成年還是未成年的動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system,CNS)內(nèi)都有神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcells,NSCs)的存在,這類細(xì)胞群能自我更新,并且具有分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力,在一定條件下可以進(jìn)行增殖、遷移和分化,在一定的程度上參與修復(fù)缺損的神經(jīng)功能,但是在成體中樞神經(jīng)損傷后此類細(xì)胞再生能力有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能完成神經(jīng)功能再生修復(fù)的

4、功能,特別是大面積受損的中樞神經(jīng)組織,僅靠自身的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。隨著干細(xì)胞研究的不斷進(jìn)步,已經(jīng)有大量的研究通過(guò)自體或者異體移植不同的干細(xì)胞(包括不同來(lái)源的成體間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等)而取得了一些令人振奮的效果,所以干細(xì)胞移植治療顱腦創(chuàng)傷后中樞神經(jīng)功能缺損為我們帶來(lái)了新的希望。在種子細(xì)胞來(lái)源方面,骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)來(lái)源豐富易獲取,有研究表明成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外可

5、快速有效地誘導(dǎo)分化成為成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(human adult bone marrow-derived neural stem cells,MDNSCs),而且成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞具有和自身腦源性的神經(jīng)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特征,如果應(yīng)用于患者自身移植,避免了可能的免疫排斥反應(yīng),并且沒(méi)有倫理爭(zhēng)議。除了要解決種子細(xì)胞的問(wèn)題外,還要改善損傷局部的微環(huán)境,使其適于神經(jīng)組織的修復(fù),同時(shí)移植入外源性細(xì)胞替代失去功能或死亡的細(xì)胞,并與宿主細(xì)胞形

6、成具有功能的整合,改善神經(jīng)功能缺陷。組織工程支架材料的發(fā)展為解決這一問(wèn)題帶來(lái)了希望,支架材料類似于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,提供種子細(xì)胞粘附的支架,在代替細(xì)胞外基質(zhì)方面起著重要的作用,目前研究的神經(jīng)組織工程支架材料主要有:天然生物材料、合成材料、化學(xué)修飾材料、復(fù)合材料、生物衍生材料及納米材料等。鑒于以上因素,本實(shí)驗(yàn)選用骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)得到的神經(jīng)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞與作為支架材料的基質(zhì)膠(BD Biosciences,Matrigel)聯(lián)合移

7、植來(lái)觀察對(duì)腦損傷的修復(fù)作用。
　　 種子細(xì)胞來(lái)源的不斷豐富和組織工程支架材料的不斷改進(jìn),推動(dòng)干細(xì)胞移植療法的發(fā)展,但是在應(yīng)用干細(xì)胞療法之前我們有很多問(wèn)題需要解決,其中如何通過(guò)非侵入性的方法對(duì)干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移分化和功能情況等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估就是其中之一,因?yàn)橐浦布?xì)胞和宿主細(xì)胞之間的相互作用和功能聯(lián)系的機(jī)制還不甚清楚,而這些是我們把干細(xì)胞移植療法應(yīng)用于臨床之前需要解決的問(wèn)題,一種有效的非侵入性的評(píng)估干細(xì)胞移植療法的方法對(duì)于我們制定臨

8、床策略和評(píng)價(jià)預(yù)后同樣重要。在現(xiàn)有的多種方法中,神經(jīng)影像學(xué)用于活體示蹤是目前研究最熱門的方法之一,主要包括磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)技術(shù),核醫(yī)學(xué)技術(shù),熒光和生物發(fā)光技術(shù)等。通過(guò)縱向長(zhǎng)期評(píng)價(jià),而不需要處死動(dòng)物,活體示蹤能夠更好的研究移植后細(xì)胞的遷移和移植細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制,這些不僅對(duì)于發(fā)展干細(xì)胞療法有促進(jìn)作用而且對(duì)于將來(lái)的臨床應(yīng)用有更大的實(shí)用價(jià)值。
　　 目前國(guó)內(nèi)外的研究多是從結(jié)構(gòu)上活

9、體示蹤移植干細(xì)胞的存活和遷移,如SPIO(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)的應(yīng)用等,但這些標(biāo)記物結(jié)合影像學(xué)活體示蹤無(wú)法從功能上追蹤移植細(xì)胞在宿主神經(jīng)組織內(nèi)的功能狀態(tài),所以我們需要從功能上評(píng)估和示蹤移植干細(xì)胞與宿主組織的功能整合。在功能成像研究方面,以往采用的FDG PET(F-fluoro-deoxy-D-glucose PET)及BOLD MRI(blood oxygenationlevel dep

10、endent MRI)方法只可提供區(qū)域腦組織活動(dòng)的間接指標(biāo)信息-腦局部糖代謝變化,尚難以直接反映神經(jīng)功能活動(dòng)變化,特別是尚無(wú)法在細(xì)胞水平上直接反映移植干細(xì)胞的功能活動(dòng)。由此本實(shí)驗(yàn)組考慮應(yīng)用活性誘導(dǎo)錳離子增強(qiáng)磁共振技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植后功能恢復(fù)評(píng)估的前期研究。
　　 錳離子增強(qiáng)磁共振成像(manganese-enhanced MRI,MEMRI)技術(shù),是一種功能磁共振成像技術(shù)。1997年,Lin YJ and Koretsky

11、AP首次應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行大鼠電刺激前肢后腦功能成像,并闡述了MEMRI功能成像的原理:利用神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生電活動(dòng)時(shí)電壓依賴性鈣離子通道開放,而錳離子作為鈣離子的類似物、可以通過(guò)開放的電壓依賴性鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞,加之錳離子是一種順磁性物質(zhì),從而可以起到標(biāo)記發(fā)生電活動(dòng)的神經(jīng)細(xì)胞的作用,使這些激活的區(qū)域獲得磁共振增強(qiáng)效果,這基于其可以通過(guò)開放的電壓依賴性鈣離子通道進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞及在局部用藥時(shí)可以沿神經(jīng)束順行傳遞這兩方面特性,而且錳離子在神經(jīng)功能活動(dòng)

12、發(fā)生時(shí)迅速進(jìn)入激活的神經(jīng)元后,在細(xì)胞內(nèi)的清除期較長(zhǎng),錳離子可以在激活的神經(jīng)元中持續(xù)增加聚集,這種錳離子顯像時(shí)程累積效應(yīng)將有助于從數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的移植細(xì)胞中捕捉到更細(xì)微、更瞬時(shí)的神經(jīng)元電活動(dòng),其既往應(yīng)用主要包括神經(jīng)功能成像、神經(jīng)束成像和腦構(gòu)筑成像等研究,近期也將其應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病成像。
　　 鑒于大鼠視覺(jué)系統(tǒng)功能和解剖的確定性,以及國(guó)內(nèi)外鮮見應(yīng)用錳離子增強(qiáng)成像技術(shù)功能成像大鼠視覺(jué)皮層的研究,本實(shí)驗(yàn)中第二部分選擇了視覺(jué)皮層為研究對(duì)象,

13、嘗試應(yīng)用動(dòng)態(tài)成像方法示蹤大鼠視覺(jué)皮層的功能活動(dòng),為神經(jīng)系統(tǒng)功能研究提供方法學(xué)上的支持。
　　 第一部分:骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合基質(zhì)膠對(duì)大鼠腦損傷的治療作用
　　 目的：目前在修復(fù)腦損傷的研究中,關(guān)于干細(xì)胞和組織工程材料聯(lián)合移植修復(fù)腦損傷的研究較少,尚鮮見有骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合基質(zhì)膠(Matrigel)修復(fù)腦損傷的研究,本實(shí)驗(yàn)主要探討胞,并用bFGF、EGF和N2等誘導(dǎo)成骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞,然后用熒光染劑DiI標(biāo)記后移植

14、。32只Wistar大鼠,隨機(jī)分為4組:正常組,生理鹽水組,單純BMSC-D-NSCs移植組,BMSC-D-NSCs聯(lián)合基質(zhì)膠移植組。采用改良自由落體撞擊腦損傷模型,損傷7天后采用損傷區(qū)移植,分別于細(xì)胞移植后1、7、14、21、28天進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分,移植4周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,相關(guān)組織學(xué)染色后,計(jì)算損傷所致空腔體積,分析移植細(xì)胞的存活和遷移情況,數(shù)據(jù)資料應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,各組治療后的體積比較采用單向方差分析；不同處理組在

15、五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)評(píng)分采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:BMSC-D-NSCs聯(lián)合Matrigel移植組比單純BMSC-D-NSCs移植組能更好的促進(jìn)腦損傷的修復(fù)。
　　 第二部分:動(dòng)態(tài)錳離子增強(qiáng)磁共振功能成像大鼠視覺(jué)皮層
　　 目的：雖然我們的前期研究表明,BMSC-D-NSCs聯(lián)合Matrigel移植組比單純BMSC-D-NSCs移植組能更好的促進(jìn)神經(jīng)功能

16、恢復(fù),但其在活體的功能情況仍不明了,本課題組擬采用動(dòng)態(tài)MEMRI功能成像來(lái)研究BMSC-D-NSCs移植后在體內(nèi)的功能情況,我們首先進(jìn)行了一些成像方法上的初步研究,本部分用動(dòng)態(tài)錳離子增強(qiáng)磁共振技術(shù)行大鼠視覺(jué)皮層功能成像,為神經(jīng)系統(tǒng)功能研究提供方法學(xué)上的參考。
　　 方法:成年雄性Wistar大鼠6只,右頸外動(dòng)脈插管后于連續(xù)的4個(gè)時(shí)段分別進(jìn)行不同的處理,第一時(shí)段(5min)成像前不給予藥物處理,無(wú)視覺(jué)刺激；第二時(shí)段(10min)成

17、像前經(jīng)右頸內(nèi)動(dòng)脈應(yīng)用甘露醇開放血腦屏障和注射氯化錳,無(wú)視覺(jué)刺激；第三時(shí)段(15min)成像前僅給與氯化錳注射,給予視覺(jué)刺激；第四時(shí)段(5min)成像前注射氯化錳與谷氨酸混合液,無(wú)視覺(jué)刺激；每一時(shí)段處理后立即進(jìn)行大鼠頭顱磁共振成像,應(yīng)用SPM軟件進(jìn)行圖像的配準(zhǔn)和平滑處理,應(yīng)用Matlab軟件得出圖像的配色圖及等高線圖；選取視覺(jué)皮層進(jìn)行興趣區(qū)(Regions of interest,ROI)分析,觀察不同處理后磁共振中腦內(nèi)特異性增強(qiáng)區(qū)域并比

18、較大鼠視覺(jué)皮層的信號(hào)強(qiáng)度,數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計(jì)分析用SPSS13.0軟件進(jìn)行,應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)比較第二階段和第三階段的差異。
　　 結(jié)果:磁共振圖像分析顯示第一、二時(shí)段大鼠腦內(nèi)未發(fā)現(xiàn)特異性增強(qiáng)區(qū)域,第三時(shí)段大鼠右側(cè)視覺(jué)皮層特異性增強(qiáng),第四時(shí)段大鼠右側(cè)腦內(nèi)多個(gè)核團(tuán)特異性增強(qiáng)；ROI 分析顯示第三時(shí)段處理后的視覺(jué)皮層信號(hào)強(qiáng)度(1.897±0.172)明顯強(qiáng)于第二時(shí)段(1.549±0.163),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。