TNF-α和p38激活在腰5前根切除引起大鼠病理性疼痛中的作用.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷常引起病理性疼痛，表現(xiàn)為痛超敏，即痛閾顯著下降；痛敏，即痛反應(yīng)增強(qiáng)和自發(fā)性疼痛。多年來(lái)，盡管國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但病理性疼痛的機(jī)制仍然不清楚。過去一直認(rèn)為周圍神經(jīng)損傷后，感覺纖維在病理性疼痛的產(chǎn)生過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后病理性疼痛的產(chǎn)生和維持并不依賴于損傷的感覺纖維，鄰近未損傷的神經(jīng)纖維可能發(fā)揮了更為重要的作用。最近，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選擇性切除大鼠腰5脊神經(jīng)前根(lumbar5ventralroottr

2、ansection，L5VRT)，而不損傷感覺神經(jīng)元，也能產(chǎn)生類似于腰5脊神經(jīng)結(jié)扎引起的病理性疼痛。但其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)采用L5VRT模型，首先通過免疫熒光組織化學(xué)和免疫熒光雙染，觀察L5VRT后不同時(shí)間DRG和脊髓背角TNF-α以及TNFR1的表達(dá)及其組織學(xué)定位，然后使用TNF-α合成抑制劑thalidomide，抑制TNF-α的合成，觀察TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛中的作用。實(shí)驗(yàn)最后還觀察了L5VRT后

3、p38在DRG和脊髓背角的激活，以及p38抑制劑對(duì)L5VRT引起痛覺過敏的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有助于認(rèn)識(shí)神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的機(jī)制。 第1部分腰5前根切除引起腫瘤壞死因子-α及其受體在大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓的表達(dá) 以往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生過程發(fā)揮重要作用。選擇性損傷大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維而保持初級(jí)感覺神經(jīng)元的完整，也能引起痛覺過敏。但L5VRT后TNF-α在DRG和脊髓背角的表達(dá)仍不清楚。采用免疫熒光組織化學(xué)和免

4、疫熒光雙染技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)首次詳細(xì)、系統(tǒng)觀察了L5VRT后，大鼠DRG和脊髓內(nèi)TNF-α和TNFR1免疫活性變化的時(shí)間過程和表達(dá)的細(xì)胞類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L5VRT能引起TNF-α和TNFR1在同側(cè)L4、L5DRG和L5雙側(cè)脊髓背角表達(dá)增強(qiáng)。在DRG，與對(duì)照組相比，L5VRT后1d就可引起TNF-α和TNFR1在大鼠同側(cè)L4和L5表達(dá)的顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，3d達(dá)到高峰(P＜0.001)，顯著性差異可保持至術(shù)后2周左右。免疫雙染結(jié)果顯示，TN

5、F-α免疫活性的增強(qiáng)主要發(fā)生在同側(cè)L4和L5DRG的神經(jīng)元和衛(wèi)星樣膠質(zhì)細(xì)胞，DRG內(nèi)浸潤(rùn)的單核-巨噬細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞也表達(dá)TNF-α。但是，TNFR1的上調(diào)則局限于神經(jīng)元，特別是IB4陽(yáng)性染色的C類神經(jīng)元。在脊髓，L5VRT可引起L5雙側(cè)脊髓背角TNF-α和TNFR1明顯上調(diào)。與假手術(shù)組比較，L5VRT后1d，同側(cè)及對(duì)側(cè)脊髓背角TNF-α和TNFR1免疫活性陽(yáng)性面積百分比顯著增加(P＜0.05)，7d達(dá)到高峰(P＜0.001)，并維持

6、至術(shù)后2周作用。免疫雙染發(fā)現(xiàn)TNF-α的上調(diào)既可見于膠質(zhì)細(xì)胞，也可見于神經(jīng)元，但是，TNFR1的表達(dá)主要發(fā)生在脊髓神經(jīng)元。上述結(jié)果提示，選擇性損傷脊神經(jīng)運(yùn)動(dòng)纖維，可引起TNF-α和TNFR1在DRG和脊髓表達(dá)增強(qiáng)，而神經(jīng)元可能是TNF-α釋放后作用的主要靶點(diǎn)。 第2部分腫瘤壞死因子-α在腰5前根切除引起大鼠病理性疼痛中的作用 以往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α在周圍神經(jīng)損傷引起病理性疼痛的產(chǎn)生過程發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)第一部分已經(jīng)發(fā)

7、現(xiàn)L5VRT可引起TNF-α及其受體TNFR1在DRG和脊髓背角的明顯上調(diào)，但TNF-α在選擇性損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維引起大鼠痛覺過敏中的作用仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)以行為學(xué)測(cè)試為指標(biāo)結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)，觀察了TNF-α合成抑制劑thalidomide對(duì)L5VRT引起大鼠病理性疼痛的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L5VRT可引起大鼠雙側(cè)后肢機(jī)械刺激和熱刺激痛覺過敏，手術(shù)前2h腹腔注射thalidomide(50mg/kg)(n=8)，而后每天1次，持續(xù)7d，能完全

8、阻斷大鼠L5VRT后熱刺激撤足潛伏期的下降，與注射溶劑組(n=6)比較，顯著性差異從術(shù)后1d，一直保持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(2周)(P＜0.05)。然而接受thalidomide腹腔注射的大鼠，其50％機(jī)械刺激撤足閾值的變化經(jīng)歷了術(shù)后1-3d下降，而后逐漸恢復(fù)至正常的過程，與注射溶劑組相比，L5VRT后5d才出現(xiàn)顯著性差異并維持到了實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P＜0.05)。但是，如果于L5VRT后第7d腹腔注射thalidomide(50mg/kg)(n=6)，

9、每天1次，至術(shù)后14d，對(duì)已經(jīng)建立起來(lái)的大鼠機(jī)械刺激和熱刺激痛覺過敏均無(wú)顯著影響。與注射溶劑組(n=6)比較，從thalidomide治療開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束機(jī)械刺激撤足閾值和熱刺激撤足潛伏期均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，無(wú)論是手術(shù)前給藥組，還是手術(shù)后給藥組，thalidomide都有效抑制了TNF-α在DRG和脊髓背角的合成。以上結(jié)果提示TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛的早期產(chǎn)生階段發(fā)揮重要作用，但不參與對(duì)病理性

10、疼痛的維持。 第3部分p38在大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角的激活及其在腰5前根切除引起病理性疼痛中的作用雖然已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷和炎癥能引起p38在DRG和脊髓背角的激活，而且應(yīng)用p38抑制劑能緩解神經(jīng)損傷引起的痛覺過敏，但選擇性損傷運(yùn)動(dòng)纖維而保持DRG神經(jīng)元的完整，是否也能導(dǎo)致p38在DRG和脊髓背角的激活，以及p38的激活在L5VRT引起病理性疼痛中的作用仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光組織化學(xué)和免疫雙染，首先觀察了L5VRT

11、后p38在大鼠DRG和脊髓背角的激活，然后通過鞘內(nèi)注射p38抑制劑SB203580并結(jié)合行為學(xué)測(cè)試，進(jìn)一步研究了p38激活在L5VRT引起病理性疼痛中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L5VRT能促進(jìn)p38在同側(cè)L5、L4DRG和L5脊髓的激活。與假手術(shù)組(n=6)比較，在DRG，L5VRT(n=6)后，磷酸化p38(phosphatedp38，p-p38)免疫活性陽(yáng)性細(xì)胞百分比于術(shù)后1d明顯升高(P＜0.05)，3d達(dá)到高峰(P＜0.01)，顯著性差

12、異可維持至術(shù)后3周左右。免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)，p38的激活主要在DRG神經(jīng)元，特別是IB4陽(yáng)性染色的C類神經(jīng)元。在脊髓，L5VRT能引起p38在L5雙側(cè)脊髓背角的激活，與假手術(shù)組(n=6)比較，L5VRT(n=6)能使p-p38免疫活性陽(yáng)性面積百分比在術(shù)后1d明顯增加(P＜0.05)，7d達(dá)到高峰(P＜0.001)，顯著性差異持續(xù)到了術(shù)后14d。免疫雙染發(fā)現(xiàn)，L5VRT后p38的激活主要局限于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞。L5被根切除(lumbar5do

13、rsalroottransection，L5DRT)能引起p38在同側(cè)L5DRG的激活，但對(duì)L4DRG和脊髓無(wú)明顯作用。表明脊髓p38的激活依賴于DRG神經(jīng)元的持續(xù)興奮。抑制TNF-α的合成，能明顯抑制p38在DRG和脊髓背角的激活。手術(shù)前10min鞘內(nèi)注射p38抑制劑(10μg/10μl)(n=8)，然后每天1次，持續(xù)14d，能完全阻斷L5VRT引起的大鼠雙側(cè)后肢熱刺激痛覺過敏和對(duì)側(cè)機(jī)械刺激痛覺過敏，與注射溶劑組(n=6)比較，熱刺激

14、潛伏期及50％機(jī)械刺激撤足閾值，顯著性差異從術(shù)后1d持續(xù)至治療結(jié)束。而大鼠同側(cè)后肢的機(jī)械刺激撤足閾值，在接受SB203580治療后的1-3d顯著下降，5d后明顯升高(P＜0.05)，2周基本恢復(fù)至正常。但是，如果于L5VRT后第8d，鞘內(nèi)一次性注射SB203580(10μg/10μl)(n=6)，對(duì)已經(jīng)建立起來(lái)的大鼠痛覺過敏無(wú)明顯作用。與L5VRT后第7d比較，接受SB203580治療后6h、12h和24h，大鼠雙側(cè)后肢的機(jī)械刺激撤足閾

15、值和熱刺激撤足潛伏期均無(wú)顯著性變化(P＞0.05)。以上結(jié)果提示運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維損傷可引起p38在DRG的激活，并可能通過增強(qiáng)DRG神經(jīng)元的興奮進(jìn)一步引起p38在脊髓背角的激活，而p38的激活在L5VRT引起病理性疼痛的起始階段發(fā)揮重要作用，但不參與病理性疼痛的維持。TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛中的作用可能是通過激活p38實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論1.選擇性切除大鼠腰5脊神經(jīng)前根，可引起TNF-α及其受體TNFR1在同側(cè)L4、L5DRG

16、和L5雙側(cè)脊髓背角表達(dá)增強(qiáng)。 2.L5VRT引起的TNF-α表達(dá)增強(qiáng)，在DRG可見于神經(jīng)元及衛(wèi)星樣膠質(zhì)細(xì)胞，在脊髓背角也發(fā)現(xiàn)于膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。但TNFR1的上調(diào)僅存在于DRG和脊髓背角神經(jīng)元。 3.TNF-α在L5VRT引起病理性疼痛的早期產(chǎn)生階段發(fā)揮重要作用，但不參與對(duì)L5VRT后病理性疼痛的維持。 4.L5VRT可引起p38在同側(cè)L4、L5DRG和L5雙側(cè)脊髓背角的激活。在DRG，p38主要激活于神經(jīng)元，而