骨癌痛大鼠脊髓背根神經節(jié)河豚毒素不敏感鈉離子通道表達變化的研究.pdf

1、骨癌痛是惡性腫瘤相關的慢性疼痛，常伴有靜息痛、自發(fā)痛、運動觸發(fā)痛等一系列癥狀，嚴重影響了病人的生理功能和心理狀況。阿片類藥物對骨癌痛緩解作用有限，且有許多副作用。放射療法雖然對骨癌痛有較好的療效，但是多數(shù)晚期癌癥病人身體狀況較差，難以耐受放射治療帶來的副作用。因此，深入研究骨癌痛發(fā)生發(fā)展的病理生理學機制是非常重要的。
　　 研究一,骨癌痛大鼠脊髓DRG神經元中Nav1.8和Nav1.9的表達變化
　　 目的：通過建立大鼠

2、脛骨轉移性骨腫瘤模型并研究其DRG神經元上河豚毒素不敏感鈉離子通道Nav1.8和Nav1.9的mRNA和蛋白質的表達變化，來探索Nav1.8和Nav1.9在骨癌痛發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：Sprague-Dawley大鼠56只隨機分為三組：假手術組(sham，n=17)，骨癌痛模型7天組(C7，n=17)，骨癌痛模型14天組(C14，n=18)。三組大鼠分別于左后肢脛骨上段髓腔內注射5μL生理鹽水(sham組)或1×104

3、/μL walker256鼠源性乳腺癌細胞生理鹽水懸浮液(C7組和C14組)，建立癌痛模型。術后密切觀察大鼠精神狀況并進行運動評分，用CO2激光熱刺激儀和Von Frey filament(VFF)細絲測量大鼠左后肢熱痛敏縮足閾值(Paw withdrawal threshold，PWT)和機械痛敏縮足閾值的變化并記錄大鼠體重。分別于術后7天和14天對大鼠行影像學和病理學檢查，以確定瘤組織的生長。在各組觀察期結束時，分別取左側腰4、腰5

4、(L4、L5)DRG。相對定量PCR，免疫印跡和免疫熒光分別用來檢測DRG上Nav1.8和Nav1.9的mRNA和蛋白質的表達變化。
　　 結果:實驗過程中sham組大鼠體重升高，C7、C14組大鼠于術后5～7天開始出現(xiàn)體重降低。與sham組大鼠相比，C7、C14術側后肢機械痛敏縮足閾值和熱痛敏縮足閾值明顯下降，但是非術側后肢未發(fā)現(xiàn)明顯差異。病理學圖像確認了兩癌痛組大鼠脛骨內腫瘤的浸潤生長。X線圖像表明，C7組脛骨破壞不明顯，C

5、14組有明顯的骨質破壞，甚至有骨皮質的缺損，癌痛模型成功的比率為32/34。
　　 與sham組相比，C14組Nav1.8和Nav1.9的mRNA相對表達量明顯升高(分別是8.9倍和9倍，P<0.01)，但是C7組的mRNA升高無明顯統(tǒng)計學意義(分別是1.5和2.4倍，P>0.05)。免疫印跡和免疫熒光的結果表明，與sham組相比較，C14組Nav1.8和NaV1.9的蛋白表達量的升高有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是在C7組中

6、這兩個亞基蛋白表達量沒有明顯變化(P>0.05)。
　　 結論:大鼠脛骨內注射Walker256細胞可以成功制備脛骨轉移瘤模型，此模型大鼠于術后5～7天發(fā)生機械痛敏縮足閾值和熱痛敏縮足閾值的降低。手術后14天，癌痛組大鼠機械痛敏和熱痛敏縮足閾值降低更加顯著，并且大鼠脊髓左側L4、L5DRG上Nav1.8和Nav1.9的mRNA和蛋白質的表達量明顯增高，因此提示這兩個亞基可能在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。
　　 研究二,

7、用于膜片鉗研究的大鼠背根神經節(jié)細胞急性分離技術的改良
　　 目的:通過技術改良，進一步摸索適于膜片鉗實驗的成年大鼠背根神經節(jié)(Dorsalroot ganglion，DRG)細胞的急性分離方法。
　　 方法:采用顯微外科技術獲取成年大鼠DRG，采用改良的雙酶順序消化及雙血清共同培養(yǎng)法，急性分離培養(yǎng)DRG。倒置顯微鏡下觀察神經元的形態(tài)，選取已貼壁的細胞，用全細胞膜片鉗技術記錄其基本膜電生理特。加入河豚毒素(tetrodot

8、oxin.TTX)后再次記錄DRG神經元的鈉離子電流變化。
　　 結果:本實驗可獲得形態(tài)良好、結構完整的單個DRG神經元，表面光亮，胞膜完整清晰，呈圓形或者橢圓形。其靜息膜電位在55.22±4.39 mV范圍內，加入TTX后可記錄到緩慢失活的河豚毒素不敏感的(tetrodotoxin-resistant，TTX-r)鈉離子電流。其中，中等直徑DRG神經元高阻封接成功率為73.2％，高于小直徑和大直徑DRG神經元的封接成功率(P<