溫腎益氣顆粒對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重構的干預及對VEGF-A表達影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾?。–OPD）作為一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率和致殘率日益上升，嚴重危害人類的健康，居全球死亡原因的第4位。COPD的特征是氣流受限，而且氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，其發(fā)病與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。反復慢性炎癥刺激、損傷及不完全性修復導致氣道結構和功能的異常，平滑肌細胞增生、肥大，成纖維細胞增殖，膠原和氨基聚糖沉積，杯狀細胞和黏液腺增生肥大且分泌旺盛等，進而引起

2、氣道重構，而氣道炎癥、氣道重構將會促進氣流受限的不斷進展，而且難以逆轉。深入探索氣道重構的具體病理生理機制，設法阻斷 COPD病變持續(xù)進展的這一關鍵鏈，已成為研究防治 COPD的熱點。隨著研究的深入開展，發(fā)現(xiàn)肺血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、肺泡巨噬細胞和肺泡Ⅱ型細胞等均可合成、分泌或表達一種或多種生長因子，這些生長因子在分子水平上影響平滑肌細胞增殖和細胞外基質沉積，它們所發(fā)揮的作用正日益受到關注。近年來國內外開始探索血管內皮生長

3、因子（VEGF）在COPD氣道重構和血管重構中的作用。
　　對于氣道重構的防治，至今尚缺乏安全有效的藥物。中醫(yī)藥多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點治療特色決定了其在防治COPD氣道重構方面具有獨特優(yōu)勢。經過二十多年臨床實踐與應用，證明具有溫腎益氣、清熱活血功效的名老中醫(yī)經驗方——“溫腎益氣顆粒”，確能改善COPD病人臨床癥狀，減少急性發(fā)作次數(shù)。溫腎益氣顆粒是否具有調節(jié)VEGF在支氣管肺組織中的表達，進而干預氣道重構的作用，有必要作進一步的研究

4、。為此，首先需要建立一個理想的動物模型，目前比較公認的是慢性煙熏聯(lián)合氣道內滴入脂多糖（LPS）雙因素造模法。這種造模方法能夠比較理想地構建具有氣道重構現(xiàn)象的、與人類發(fā)病較為相符的COPD動物模型。
　　研究目的：
　　在建立具有氣道重構現(xiàn)象的 COPD大鼠模型的同時，觀察溫腎益氣顆粒對 COPD大鼠模型氣道重構的干預作用以及對VEGF-A表達的影響，以深入探討名老中醫(yī)經驗方的作用機制，為進一步推廣該中藥制劑提供實驗依據(jù)。

5、r>　　研究方法：
　　1.將50只健康雄性SD大鼠（清潔級），體重150±20g，隨機分為5組，即正常對照組、模型組、溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組，每組10只。
　　2.模型組、溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組煙熏10周，分別于造模第1、28天每只大鼠氣道內滴入內毒素脂多糖（LPS）200μg。
　　3.溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組同時從造模第29天開始胃飼受試藥物至第70天結束，用量依次分別為8.4g/kg

6、、4.2g/kg、2.1g/kg。
　　4.取右下葉肺組織用10％中性緩沖甲醛液固定，分別行HE染色，Masson三色染色和免疫組化檢測。運用病理圖像分析儀軟件，測量基底膜周長、細支氣管總面積、細支氣管腔面積、單位面積平均肺泡數(shù)、平均肺泡面積，測定氣道壁膠原的面積，測定VEGF在大鼠支氣管壁的陽性表達強度和表達面積。
　　5.右肺中葉予提取總RNA，逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測VEGF-AmRNA的表達量。

7、>　　6.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。
　　結果：
　　1.模型組動物體重增長與正常對照組比較明顯減緩，溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組對COPD大鼠體重增長均無明顯作用。
　　2.光鏡下模型組可見細支氣管纖毛粘連倒伏，部分上皮細胞剝脫、變性壞死，杯狀上皮細胞增生，且氣管粘膜下層、肌層出現(xiàn)不同程度的淋巴細胞、巨噬細胞等浸潤現(xiàn)象；細支氣管管壁增厚，肺泡管呈囊狀擴張，肺泡間隔斷裂，肺泡腔明顯不規(guī)則膨大。溫

8、腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組與模型組比較單位面積平均肺泡數(shù)明顯增加而平均肺泡面積明顯減小，但仍與正常對照組有顯著差異，治療組各組間未見明顯差別。溫腎益氣顆粒高、中劑量治療組能明顯減輕炎癥細胞浸潤，且對小氣道壁的增厚有明顯抑制作用，但低劑量治療組對小氣道壁增厚未見明顯抑制作用，炎癥細胞浸潤亦未見明顯減輕。
　　3. Masson染色見模型組細支氣管壁膠原較正常對照組明顯增多，溫腎益氣顆粒高劑量治療組則可明顯抑制小氣道壁膠原的增加，

9、但中、低劑量治療組未見明顯的抑制作用。免疫組化顯示模型組支氣管壁VEGF蛋白高表達，明顯高于正常對照組。溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組支氣管壁VEGF蛋白表達均明顯低于模型組，但均高于正常對照組，各組之間未見明顯差別。
　　4.模型組支氣管肺組織VEGF-A mRNA表達顯著增高。溫腎益氣顆粒高、中、低劑量干預治療后VEGF-A mRNA表達明顯降低，各組間干預效果無明顯差別。與正常對照組比較，溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組V

10、EGF-A mRNA表達明顯增高。
　　結論：
　　1.慢性煙熏聯(lián)合氣道內滴入 LPS雙因素造模法能夠較好地復制出具有氣道重構特點的COPD動物模型。
　　2. VEGF-A的高表達可能參與了COPD大鼠的氣道重構過程，研究其調控過程將有助于探索COPD復雜的發(fā)病機制。
　　3.中藥溫腎益氣顆粒可以減輕氣道重構，其機制可能與調節(jié) VEGF-A在氣道的表達有關。
　　4.溫腎益氣顆粒不同劑量之間未能顯示出明確