STAT5在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的激活及功能研究.pdf

1、目的：調(diào)查膠質(zhì)瘤組織中STAT5的激活現(xiàn)象,并探討在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中磷酸化的STAT5對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響。
　　 材料與方法：
　　 1、組織芯片的制備。
　　 腫瘤樣本來(lái)源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和北京天壇醫(yī)院診斷為膠質(zhì)瘤并接受治療的患者的術(shù)中樣本。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn),并被當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并同意使用來(lái)源于兩所醫(yī)院的組織樣本進(jìn)行科學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本來(lái)源于膠質(zhì)瘤患者

2、術(shù)中瘤組織,對(duì)照組非腫瘤樣本來(lái)源于癲癇患者行顳葉切除術(shù)的腦組織。組織在切除后快速液氮冷凍,福爾馬林固定,石蠟包埋。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,用組織芯片機(jī)(Beecher Instruments,SilverSprings,MD,USA)制備組織芯片。組織芯片樣本包括25例散發(fā)星形細(xì)胞瘤(Ⅱ級(jí)),27例間變星形細(xì)胞瘤(Ⅲ級(jí))和124例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級(jí))。在每個(gè)膠質(zhì)瘤典型病變區(qū)域提取兩個(gè)0.6mm孔徑的組織樣本,制作成由352個(gè)微點(diǎn)陣構(gòu)成的組織芯片。

3、另外,選取13例癲癇手術(shù)切除的非瘤腦組織制作成組織芯片,作為對(duì)照。
　　 2、免疫組化染色。
　　 用石蠟切片機(jī)將石蠟包埋的組織芯片的標(biāo)本切割成厚度為4μm的切片,貼附與防脫載玻片上,65℃烘干30分鐘。將石蠟切片用二甲苯脫蠟,水化,浸入EDTA中,高壓鍋抗原修復(fù)。3％H2O2滅活,山羊血清封閉。p-STAT5a/b(Tyr694/Tyr699)(Santa cruz Biotechnology,Inc,CA,USA)抗

4、體1:50稀釋,4℃孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照組用山羊血清替代一抗4℃孵育過(guò)夜。HRP標(biāo)記的二抗(KIT-5930,MaxVision,FuZhou,China)室溫孵育30分鐘。DAB顯色5分鐘。蘇木素復(fù)染,Permount(BIOS,Beijing,China)封片。顯微鏡(Olympus Optical,Japan)觀察,圖像采集。
　　 免疫組化染色強(qiáng)度由兩位病理學(xué)專(zhuān)家分別進(jìn)行觀察并結(jié)合瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定。根據(jù)

5、兩位專(zhuān)家判定分?jǐn)?shù)的均值,對(duì)p-STAT5的表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步的對(duì)比評(píng)估。瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色比例分級(jí)如下:0(無(wú)瘤細(xì)胞著色),1(瘤細(xì)胞著色比例＜10％),2(瘤細(xì)胞著色比例為10-50％),3(瘤細(xì)胞著色比例＞50％)。著色的瘤細(xì)胞比例＞20％認(rèn)為有STAT5的持續(xù)激活。染色強(qiáng)度分為0(無(wú)著色),1(弱著色,呈淡黃色),2(中等著色,呈黃褐色),3(強(qiáng)著色,呈棕色)。染色指數(shù)的的計(jì)算方法如下:染色指數(shù)=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性染色比例。染色指數(shù)≥4,

6、被認(rèn)為瘤組織中STAT5的激活水平較高,染色指數(shù)＜4,被認(rèn)為STAT5的激活水平較低。
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)和EGF激活實(shí)驗(yàn)。
　　 U87-MG為人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系,購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。U87-MG細(xì)胞用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在EGF刺激前,先將U87-MG細(xì)胞用含1‰胎牛

7、血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12小時(shí),然后用PBS沖洗細(xì)胞2次,再加入含100ng/ml EGF的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)操作手冊(cè)指導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞完畢24小時(shí)后,再加入EGF。
　　 4、免疫熒光分析。
　　 用0.25％胰酶消化對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的U87-MG細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,以6×103細(xì)胞/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(內(nèi)放蓋玻片)。24小時(shí)后移去培養(yǎng)基,PBS洗1次,饑餓培養(yǎng)過(guò)夜,替換為含100ng/mlEGF的完全培

8、養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí),用4％多聚甲醛固定10分鐘。0.25％Trixton X-100的PBS作用10分鐘,血清封閉1小時(shí)。加入p-STAT5抗體(1:50稀釋),4℃孵育過(guò)夜,Cy3標(biāo)記羊抗兔抗體(1:400稀釋),PBS洗3次,室溫孵育2小時(shí)。用熒光顯微鏡Leica DMIRE2(LeicaMicrosystems Ltd,Germany)觀測(cè),采集圖像。
　　 5、RNA干擾實(shí)驗(yàn)。
　　 STAT5 siRNA為Dh

9、armacon(Dharmacon RNA Technologies,Lafayette,CO,USA)合成的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA。根據(jù)操作手冊(cè),用DharmaFECT siRNA轉(zhuǎn)染試劑將100nM STAT5 siRNA轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)87-MG細(xì)胞。ON-TARGETplus Non-targeting siRNA作為陰性對(duì)照。STAT5的沉默效率用Western Blot檢測(cè)。
　　 6、W

10、estern Blot實(shí)驗(yàn)。
　　 按前述的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),EGF刺激及RNA干擾。EGF處理的細(xì)胞,分別在0,15,30,60,120,180,240,300分鐘收集,提取細(xì)胞核蛋白。在轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA24小時(shí)后,加入EOF,再過(guò)48小時(shí)收集,提取總蛋白。Bradford法蛋白定量。8％SDS-PAGE蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜。5％脫脂奶粉封閉30分鐘。以p-STAT5為一抗4℃孵育過(guò)夜,Histone1為內(nèi)參;以STAT5

11、為一抗4℃孵育過(guò)夜,β-actin為內(nèi)參。PBST沖洗3次,每次5分鐘。HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時(shí)。PBST沖洗3次,每次5分鐘,ECL發(fā)光。
　　 7、半定量RT-PCR。
　　 U87-MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA或陰性對(duì)照siRNA24小時(shí)后,給予EGF刺激,24小時(shí)后將各組細(xì)胞RNA用Trizol一步法提取出來(lái),并以500ngRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)引物Cyclin D1:forward:5'

12、-CTGTGCTGCGAAGTGGAAACCAT-3';reverse:5'-TTCATGGCCAGCGGGAAGACCTC-3',COX-2:forward:5'-TTCAA ATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3';reverse:5'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3',內(nèi)參β-actin:forward:5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3';reverse:5'-CTCGTCATACT

13、CCTGCTTG-3'擴(kuò)增目的基因。引物由TakaraBiotechnology(Dalian,China)合成。PCR儀設(shè)定程序?yàn)?4.0℃30秒,55℃30秒,72℃30秒,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán),產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖電泳100V30分鐘,紫外線成像,結(jié)果使用Sigma-Gel software進(jìn)行分析。
　　 8、MTT分析。
　　 我們通過(guò)MTT法來(lái)研究STAT5 siRNA及EGF對(duì)U87-MG細(xì)胞增殖的影響。將轉(zhuǎn)染24

14、小時(shí)的細(xì)胞胰酶消化制成懸液,計(jì)數(shù)3次,向96孔板每孔加細(xì)胞懸液200μl,約含5000個(gè)細(xì)胞,然后加入EGF,對(duì)照組只加相同體積的培養(yǎng)基。分別在0,24,48,72,96小時(shí)取出1個(gè)96孔板,每孔加20μl5mg/ml的MTT,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),將培養(yǎng)基吸出,每孔加150μlDMSO,震蕩10分鐘。570nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值。
　　 9、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　 將50mg/L基質(zhì)膠(BD bioscienc

15、e,San Jose,CA,USA)與無(wú)血清培養(yǎng)基以1:7比例混合,取50μl鋪于Transwell小室底部膜的上室面,待凝固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的U87-MG細(xì)胞胰酶消化制成懸液計(jì)數(shù)3次,向Transwell小室上室內(nèi)加細(xì)胞懸液200μl(含1％FBS),約含2000個(gè)細(xì)胞。向下室加500μl培養(yǎng)基(含20％FBS),再向上室及下室同時(shí)添加EGF,對(duì)照組只加同體積的培養(yǎng)基。24小時(shí)后,用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。用甲醇和冰

16、乙酸按1:3的比例配制成固定液,將細(xì)胞固定30分鐘。風(fēng)干后,用Giemsa工作液染色10分鐘,200倍視野下隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。在另外的組別中為了抑制STAT5的磷酸化,細(xì)胞用STAT5的特異磷酸化抑制劑Lestaurtinib(CEP701,Cephalon,West Chester,PA,USA)替代siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 10、細(xì)胞周期分析。
　　 按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染及EGF刺激,在EGF刺激24小時(shí)后收集

17、細(xì)胞,不少于1×106。PBS洗2次,70％乙醇-20℃固定12小時(shí),PBS洗1次,碘化丙啶(PI)染色30分鐘,流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur CellSorting System)分析。
　　 11、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 不同組間的比較用單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)都用Systat軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、在膠質(zhì)瘤組織中STAT5持續(xù)激活。
　　

18、2、在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG中,EGF能激活STAT5。
　　 3、STAT5 siRNA無(wú)論是否有EGF的刺激均能抑制U87-MG細(xì)胞的增殖。
　　 4、STAT5 siRNA無(wú)論是否有EGF刺激均可抑制U87-MG細(xì)胞的侵襲。
　　 結(jié)論：
　　 STAT5在人腦膠質(zhì)瘤組織及U87-MG細(xì)胞系中均有表達(dá);人腦膠質(zhì)瘤組織中存在STAT5的激活;在體外人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG中無(wú)STAT5的激活,但