SupCD28 Mab對Foxp3EGFP小鼠體內(nèi)表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞的擴(kuò)增作用及對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型的治療效果的研究.pdf

1、背景與目的:
　　CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)為一類具有免疫抑制功能的獨(dú)立的T細(xì)胞群,約占外周CD4+T細(xì)胞的5％-10％,是機(jī)體維持自身免疫耐受的重要組成部分。越來越多的研究證明這群T細(xì)胞在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反應(yīng)、腫瘤免疫和維持機(jī)體免疫平衡等方面發(fā)揮著重要作用。SuperagonisticCD28-specific monoclonal antibody(CD28超協(xié)單克隆特異性抗體,s

2、upCD28 MAb,clone:D665)可以激活T細(xì)胞,并且選擇性的擴(kuò)增CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞,從而增強(qiáng)其在體內(nèi)抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)自身免疫的作用。
　　已有研究表明CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在IBD的發(fā)病中起著重要的作用,缺乏Treg細(xì)胞的小鼠對腸道共生菌群產(chǎn)生高反應(yīng)性,引起嚴(yán)重的自身免疫性腸炎。而輸注Treg細(xì)胞可以減輕SCID小鼠由CD4+CD45RBHIGHT細(xì)胞所誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。葡萄糖硫酸鈉(D

3、extran Sodium Sulfate,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎類似于人類潰瘍性結(jié)腸炎,是目前公認(rèn)的研究IBD的動物模型。
　　本實(shí)驗(yàn)研究目的為:(1)通過supCD28 MAb腹腔注射后對Foxp3EGFP小鼠Treg細(xì)胞的擴(kuò)增作用以及對Foxp3,Th1,Th2分化途徑相關(guān)細(xì)胞因子的影響的,以期闡述單次注射supCD28 Mab后不僅在數(shù)量上擴(kuò)增Treg,且通過不同的抗體標(biāo)記,證明擴(kuò)增的Treg與體內(nèi)原有的Treg具有相同的功

4、能。(2)通過supCD28 Mab腹腔注射后對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型的療效觀察,以期為IBD的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分:30只Foxp3EGFP小鼠隨機(jī)分為正常對照組,supCD28 Mab注射1-4組,每組6只。對照組不做處理,supCD28 Mab組給予一次腹腔注射supCD28 Mab1mg/只,1-4組分別于注射后第3天,第7天,第14天,第30天取脾臟,腸系膜淋巴結(jié),胸腺及外周靜脈血的淋

5、巴細(xì)胞,經(jīng)抗CD4,CD62L,CD103,CD152染色,于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析比較各組Treg細(xì)胞的變化情況。各組小鼠脾臟取淋巴細(xì)胞,提取RNA后,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,對Foxp3,IFN-γ,TNF-α,IL-6,IL-10,TGF-β進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析,比較各因子的變化情況。
　　第二部分:20只Foxp3EGFP小鼠隨機(jī)分為空白對照組(n=6)、3.5％DSS組(n=6)、和DSS模型supCD28 Mab給藥組(n=

6、8)?？瞻讓φ战M給予蒸餾水自由飲用,3.5％DSS組和給藥組均予3.5％的DSS溶液自由飲用5天,給藥組在飲用3.5％DSS第一天給予腹腔注射supCD28 MAb1mg/只。每日進(jìn)行疾病活動標(biāo)準(zhǔn)(DAI)評分。第8天處死所有小鼠,取結(jié)腸標(biāo)本測量長度,做HE染色,行結(jié)腸病理學(xué)評分。模型組和給藥組取脾臟,腸系膜淋巴結(jié),淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗CD4,CD62L,CD103,CD152染色,于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析比較兩組Treg細(xì)胞的變化情況。結(jié)腸,

7、脾臟細(xì)胞提取RNA后,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,對Foxp3,IFN-γ,TNF-α,IL-6,IL-10,TGF-β細(xì)胞因子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析,比較各因子的變化情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.注射supCD28MAb后第3天,小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)較對照組有顯著增大,而胸腺與對照組相比體積變化不大。小鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)的Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞增加約3倍,外周血Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞增加約

8、2倍。胸腺中Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞在兩組中沒有顯著差異。
　　2.腸系膜淋巴結(jié)中Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞在注射后第3天達(dá)到頂峰,隨后逐漸下降,至第30天左右可恢復(fù)到接近對照組水平。脾臟及外周血中Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞在注射后第7天達(dá)到頂峰,隨后逐漸下降,至第30天左右可恢復(fù)到接近對照組水平。胸腺細(xì)胞中Foxp3+CD4+Treg細(xì)胞一直無顯著增加或減少。
　　3.脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD1

9、03+Foxp3+Treg細(xì)胞,CD4+CD152+Foxp3+Treg細(xì)胞,CD4+CD62L+Foxp3+Treg細(xì)胞在注射后第三天較對照組均顯著增加,倍數(shù)約5-10倍。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示:脾臟淋巴細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)較對照組顯著增加,注射后第3天達(dá)到高峰,約為18.5倍。脾臟淋巴細(xì)胞中Th1及Th2途徑的細(xì)胞因子也有增加,其中以Th2途徑中IL-10的增加最為顯著,第3天達(dá)到151倍。
　　第二部分:

10、
　　1.DSS模型supCD28 MAb給藥組小鼠一般情況優(yōu)于DSS模型組小鼠。全結(jié)腸長度8.00±0.44cm長于DSS模型組6.63±0.30cm(p＜0.05);DAI評分1.75±0.88顯著低于DSS模型組3.41±0.57,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。病理組織學(xué)評分8.50±5.07也顯著低于DSS模型組29.00±3.83(p＜0.05)。
　　2.supCD28 MAb給藥組小鼠在脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中C

11、D4+CD103+Foxp3+Treg細(xì)胞,CD4+CD152+Foxp3+Treg細(xì)胞,CD4+CD62L+Foxp3+Treg細(xì)胞均高于DSS模型組。
　　3.實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示:抗炎細(xì)胞因子Foxp3,IL-10,TGF-β在DSS組小鼠結(jié)腸及脾臟的表達(dá)都顯著減少,但在supCD28 MAb給藥組中均有增加。促炎細(xì)胞因子IL-6在DSS組小鼠的結(jié)腸組織中表達(dá)要比supCD28 MAb給藥組小鼠顯著增高。
　　結(jié)論

12、:
　　1.單次腹腔注射supCD28 MAb可以選擇性的擴(kuò)增CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞,且擴(kuò)增Treg與體內(nèi)原有的Treg細(xì)胞具有相同的免疫學(xué)功能。
　　2.supCD28 MAb擴(kuò)增CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞后可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)Foxp3,Th1,Th2,Treg途徑的細(xì)胞因子的變化,其中以大量分泌Foxp3,IL-10為主。
　　3.supCD28 MAb通過增加小鼠體內(nèi)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞水