八棱海棠與水稻AP2-EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析.pdf

1、植物在其整個(gè)生活周期中，無時(shí)不處于變化著的環(huán)境中。干旱、高鹽和低溫是諸多非生物逆境中對(duì)作物危害最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害，長(zhǎng)期以來，人們都非常關(guān)注對(duì)這種非生物脅迫的研究。通常在逆境條件下，植物能感知、傳遞逆境脅迫信號(hào)，誘導(dǎo)相關(guān)功能基因的表達(dá)，在生理生化上作出適應(yīng)性響應(yīng)。而轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號(hào)傳遞，相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控及發(fā)育階段的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)控植物發(fā)育且與植物脅迫抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，目前擬南芥和水

2、稻中與干旱、高鹽和低溫相關(guān)的AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子研究得比較深入。其中，DREB和ERF類轉(zhuǎn)錄因子可能參與了生物脅迫和非生物脅迫。但對(duì)于蘋果等木本植物的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。因此從八棱海棠中克隆類似的轉(zhuǎn)錄因子將具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。本研究中利用水稻作為一種模式植物以順式調(diào)控元件DRE和ERE為誘餌，通過“酵母單雜交”的方法從水稻cDNA文庫中篩選獲得了能夠與ERE序列特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子OsAP25和能夠與DRE序列特異性結(jié)

3、合的轉(zhuǎn)錄因子OsDREBlA并分別對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和逆境環(huán)境下的表達(dá)分析。根據(jù)氨基酸序列的同源性和序列的結(jié)構(gòu)特征，除了OsDREB1A基因，所克隆到的OsAP25基因是還未見報(bào)道的新基因。OsAP25轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列分析表明，該基因含有1035bp的開放閱讀框(ORF)，推測(cè)編碼345個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為36.4kDa，等電點(diǎn)(pl)為5.54。它也具有ERF類轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特征，N-端和C-端富含酸性氨基酸，推測(cè)

4、為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；C-端有一個(gè)富含堿性氨基酸區(qū)推測(cè)為核定位信號(hào)區(qū)(NLS)；在C-端還有一個(gè)特有的MAP位點(diǎn)作為激活區(qū)；中間是由58個(gè)氨基酸組成的保守的DNA結(jié)合域(ERF結(jié)構(gòu)域)，其第13位和18位分別為丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)。根據(jù)擬南芥DREB類基因序列和水稻基因組序列比對(duì)后，得到5個(gè)相似序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RACE方法從八棱海棠cDNA庫中擴(kuò)增出編碼AP2/EREBP蛋白的基因MrDREB2A。根據(jù)核苷酸推測(cè)的氨基酸序列分析

5、顯示，所編碼的蛋白具有DREB轉(zhuǎn)錄因子的一些典型特征：由58個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域中含有第13位的纈氨酸(V)和第18位的亮氨酸(L)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MrDREB2A屬于DREB(A-6亞族)類轉(zhuǎn)錄因子。 利用RT-PCR分別分析了OsAP25和MrDREB2A基因的表達(dá)特性。試驗(yàn)結(jié)果表明，OsAP25基因的轉(zhuǎn)錄依賴于ABA，受干旱、高鹽和低溫的誘導(dǎo)，而乙烯也微弱地激活了OsAP25基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；MrDREB2A基因受到