痔血膠囊組方肝毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、痔血膠囊是一種純中藥復(fù)方制劑,由苦參和白鮮皮兩味中藥組成,主治I、II期內(nèi)痔所致的便血、肛門(mén)墜漲或墜痛等癥狀。該藥屬中藥6類(lèi)新藥,于2004年開(kāi)發(fā)上市。組方的苦參(RadixSophoraflavescentis,Kushen)是豆科槐屬植物苦參(SophoraflavescensAit)的干燥根,白鮮皮(CortexDictanmi,Baixianpi)是蕓香科植物白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz)的干燥根皮,兩

2、藥皆為我國(guó)傳統(tǒng)中藥,味苦性寒,具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的功效。其中白鮮皮為君藥,加用苦參增強(qiáng)白鮮皮清熱除濕的功效,從病因上治療痔瘡。
　　近年來(lái)國(guó)家不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心不斷收到痔血膠囊引起肝毒性的報(bào)告,報(bào)告數(shù)于2008年達(dá)到頂峰,最終該藥于2008年11月由生產(chǎn)企業(yè)召回,但尚未撤出市場(chǎng),其應(yīng)用前景有待于它與肝毒性之間的因果關(guān)系評(píng)估。值得注意的是,苦參和白鮮皮兩味中藥均含有已知的“保肝”成分,由它們組方制成的痔血膠囊何以會(huì)造成肝臟損害機(jī)制

3、不明。
　　為明確痔血膠囊與肝毒性之間的因果關(guān)系及可能的毒性成分,本課題先在離體水平從痔血膠囊組方中確定潛在的肝毒性藥味,再在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證肝毒性藥味對(duì)肝功能和肝組織學(xué)形態(tài)的影響。進(jìn)一步利用半制備HPLC分離技術(shù)遵循活性追蹤分離的思路分離得到可能的肝毒性組分,確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　第一部分：痔血膠囊組方中肝毒性藥味的確定目的在原代大鼠肝細(xì)胞模型上確定痔血膠囊組方中引起肝毒性的藥味。方法根據(jù)痔血膠囊專(zhuān)利制備實(shí)驗(yàn)用藥,得到白

4、鮮皮醇提物(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“白鮮皮”,得率10.7％)、苦參醇提物(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“苦參”,得率20.0％)及苦參白鮮皮復(fù)方醇提物(按痔血膠囊中兩藥配比,以下簡(jiǎn)稱(chēng)“復(fù)方”,得率12.5％)?？鄥⑺睾涂鄥A為市售對(duì)照品。二步灌流法分離原代大鼠肝細(xì)胞,將上述藥品分別作用于原代肝細(xì)胞一定時(shí)間,MTT方法檢測(cè)肝細(xì)胞活力,比較不同藥物的細(xì)胞毒性。結(jié)果孵育3h后,白鮮皮組(74-250μg/m1)與對(duì)照組的肝細(xì)胞活力無(wú)顯著差異(P＞0.05),苦參111μg/

5、ml、167μg/ml和250μg/ml組的肝細(xì)胞活力分別是對(duì)照組的101.6％、25.9％、9.7％,復(fù)方在74-250μg/ml濃度范圍內(nèi)與對(duì)照組細(xì)胞的活力無(wú)顯著差異(P＞0.05)?？鄥⒆饔?h,6h,12h后抑制肝細(xì)胞活力的IC50分別是162.9(1.55.8-170.4),144.5(141.9-147.1),143.O(140.9-145.3)μg/ml。痔血膠囊主要有效成分苦參素和苦參堿在0.05-5mM:濃度范圍內(nèi)未見(jiàn)

6、抑制肝細(xì)胞活力。結(jié)論痔血膠囊組方中苦參具有肝細(xì)胞毒性,且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性。同濃度下白鮮皮對(duì)肝細(xì)胞沒(méi)有毒性作用?？鄥⑺睾涂鄥A在較高濃度下也未見(jiàn)肝毒性。
　　第二部分：苦參肝毒性的整體實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯靠鄥⒔?jīng)不同給藥途徑對(duì)整體動(dòng)物肝臟的影響。方法將小鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組和苦參50mg/kg組,尾靜脈注射給藥。每天一次,連續(xù)7天,檢測(cè)小鼠血清ALT和AST水平。將大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、苦參2.5g/kg組、5g/kg組,灌胃給藥,每天

7、一次,連續(xù)7天,于第3天和第7天檢測(cè)大鼠血清ALT和AST、水平。大鼠肝組織切片經(jīng)HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果靜注給藥7天后,苦參組小鼠血清ALT水平顯著升高至對(duì)照組的1.33倍。灌胃給藥3天后,2.5g/kg和5g/kg苦參組大鼠血清ALT水平升高至對(duì)照組的1.48倍和1.53倍。灌胃7天后,2.5g/kg和5g/kg苦參組大鼠血清ALT水平分別為對(duì)照組的1.43倍和1.60倍。肝組織病理檢查顯示,苦參組大鼠肝細(xì)胞明顯腫脹,肝竇狹

8、窄,肝細(xì)胞以水樣變性為主,同時(shí)可見(jiàn)空泡變性。結(jié)論苦參靜注和灌胃給藥可造成小鼠和大鼠肝損傷,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶升高和肝臟組織學(xué)變性。肝損傷嚴(yán)重程度沒(méi)有隨苦參給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而有顯著加重。
　　第三部分苦參中肝毒性組分的分離和表征目的分離和鑒定苦參醇提物中的肝毒性化合物。方法利用半制備HPLC方法分離并收集不同保留時(shí)間的組分:FR1(12-17min);FR2(20-25min);FR3(26.5-31min);FR4(33-37min);F

9、R5(38.5-40min);FR6(43-51mi);FR7(52-56.5min);FR8(60-64.5min)。將各組分中的流動(dòng)相揮干后稱(chēng)重,每個(gè)組分設(shè)立3個(gè)濃度(50μg/ml,100μg/ml,200μg/m1),與原代大鼠肝細(xì)胞作用3h,用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力,比較各組分的肝毒性。重復(fù)收集強(qiáng)毒性組分中的主要峰,經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR確定結(jié)構(gòu),測(cè)定抑制肝細(xì)胞活力的IC50。結(jié)果按出峰時(shí)間先后,組分FR1～FR8

10、的極性依次遞減,在濃度50μg/ml時(shí)8個(gè)組分作用3小時(shí)后,肝細(xì)胞活力分別為對(duì)照組的96.0％、102.3％、99.9％、86.1％、77.7％、112.5％、7.5％、21.1％。組分FR5、FR7和FR8組的肝細(xì)胞活力與正常組有顯著差異(p＜0.05)。其中,FR7和FR8的肝細(xì)胞毒性明顯大于其他6個(gè)組分。將FR7和FR8進(jìn)一步分離后,從FR7中得到苦參酮(kurarinone,Kur),從FR8中分離得到槐屬黃酮G(sophora