乳腺癌細(xì)胞體外選擇性原代培養(yǎng)及鑒定的研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)乳腺癌患者的癌組織進(jìn)行體外細(xì)胞原代培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況及規(guī)律，適時(shí)的進(jìn)行細(xì)胞傳代及凍存，為后續(xù)的HSP70-HER蛋白復(fù)合物提純及檢測(cè)提供基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作。
　　方法：
　　選取2014年2月至2015年1月期間在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院住院患者52例作為志愿者，所有患者病理學(xué)診斷明確，均為初次診斷及手術(shù)，患者在進(jìn)行手術(shù)治療切除乳腺癌組織前必須未接受過任何的內(nèi)分泌治療、放射治療及化學(xué)藥物治療，患者的年

2、齡范圍為28-74歲，平均年齡為47.67±11.78歲。術(shù)前告知志愿者后續(xù)可能需要捐獻(xiàn)少量的外周血和乳腺癌組織，與患者及家屬簽署自愿同意書，記錄患者相關(guān)情況并配以數(shù)字代碼。術(shù)中留取部分癌組織待術(shù)中冰凍結(jié)果明確后放入盛有無菌乳腺癌洗滌液的離心管中。后在超凈工作臺(tái)中對(duì)癌組織進(jìn)行初步處理。對(duì)已處理的組織進(jìn)行消化，消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)所得的細(xì)胞數(shù)將乳腺癌細(xì)胞接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液使細(xì)胞均勻的懸浮于培養(yǎng)液中，二氧化碳的

3、培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，定期換液、細(xì)胞傳代，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)得到具體數(shù)值凍存細(xì)胞并留取少量細(xì)胞進(jìn)行純度及細(xì)胞活率檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　?。?）所取乳腺癌組織標(biāo)本大小范圍為0.25-1.2cm3，平均大小為0.68±0.25cm3，對(duì)組織進(jìn)行消化后細(xì)胞數(shù)范圍為4.03-14.00X105/ml.平均細(xì)胞數(shù)為8.76±2.35X105/ml.消化時(shí)間范圍為10-24h，平均消化時(shí)間為14.

4、62±1.81h。
　?。?）細(xì)胞原代培養(yǎng)24小時(shí)后，顯微鏡下觀察可見大部分細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，少量細(xì)胞仍懸浮于培養(yǎng)液中，不能貼壁。培養(yǎng)48小時(shí)后，鏡下觀察細(xì)胞基本全部呈貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)過程中平均每?jī)商爝M(jìn)行一次細(xì)胞換液，每三天進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。
　?。?）當(dāng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至9-10天，傳代至第三代后，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，迅速生長(zhǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)良好且細(xì)胞數(shù)大量增加。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定數(shù)量后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存，凍存前對(duì)細(xì)胞行檢測(cè)細(xì)胞活率均高于

5、86％,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行HE染色后，經(jīng)本院病理診斷科觀察后腫瘤細(xì)胞純度均在75%以上。
　?。?）隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活力下降，數(shù)量逐漸減少，當(dāng)細(xì)胞傳至第五代后，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)變差并大量出現(xiàn)死亡細(xì)胞，不能夠進(jìn)行下一次傳代，部分細(xì)胞可見成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)并增殖。
　?。?）所培養(yǎng)的52例乳腺癌細(xì)胞中，40例成功凍存；細(xì)胞發(fā)生污染現(xiàn)象8例，其中細(xì)菌污染7例，真菌污染1例；6例細(xì)胞未生長(zhǎng)增殖到凍存所需狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)成功率為

6、76.92%。
　　結(jié)論：
　?。?）乳腺癌細(xì)胞可以進(jìn)行體外選擇性原代培養(yǎng)并增殖達(dá)到凍存，且經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)方法可以獲得純度較高的乳腺癌細(xì)胞。
　?。?）定期的進(jìn)行換液和細(xì)胞傳代能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境，能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞傳代可在一定程度上刺激乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)并增殖。
　?。?）準(zhǔn)確地細(xì)胞活率檢測(cè)及腫瘤細(xì)胞純度檢測(cè)能夠?yàn)楹罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)提供重要的借鑒工作。
　?。?）細(xì)胞凍存條件的掌握能夠?yàn)楹罄m(xù)