雪旺氏細(xì)胞共培養(yǎng)對成肌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響.pdf

1、隨著骨骼肌相關(guān)疾病如骨骼肌損傷，肌營養(yǎng)不良，肌萎縮和肌肥大等的發(fā)病率越來越高，有關(guān)骨骼肌損傷后修復(fù)、再生和重建的細(xì)胞和分子水平的機(jī)制研究日益受到研究者的高度關(guān)注。應(yīng)用組織工程學(xué)原理和技術(shù)方法研究復(fù)合型的骨骼肌重建，進(jìn)而修復(fù)肌損傷，是一種創(chuàng)新的研究。 成肌細(xì)胞（Myoblast）由骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（Skeletal satellitecell）分化而來，來源于胚胎的中胚層細(xì)胞，在胚胎的發(fā)育過程中不斷增殖、分化為成熟的骨骼肌組織，成肌

2、干細(xì)胞以肌衛(wèi)星細(xì)胞形式存在于肌纖維的肌膜和基底膜之間。生理狀態(tài)下，肌衛(wèi)星細(xì)胞以靜止未分化狀態(tài)存在，骨骼肌受到損傷時肌纖維開始壞死，巨噬細(xì)胞吞噬壞死細(xì)胞和肌纖維基底膜，此時肌衛(wèi)星細(xì)胞激活分裂為紡錘形的成肌細(xì)胞，相互融合為肌管，發(fā)育形成再生肌纖維。雪旺細(xì)胞（schwann cells，SC）是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，包繞周圍神經(jīng)軸突形成有髓或無髓神經(jīng)纖維。SC能夠分泌表達(dá)數(shù)種神經(jīng)營養(yǎng)因子；防止受損神經(jīng)元胞體的死亡；促進(jìn)軸突髓鞘化，從而促進(jìn)損

3、傷的周圍及中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生等。當(dāng)周圍神經(jīng)肌肉損傷時，雪旺細(xì)胞增生活躍并分泌釋放大量的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)以促進(jìn)神經(jīng)再生并參與維持正常骨骼肌的形態(tài)和功能以及損傷肌肉和神經(jīng)的修復(fù)。體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞受睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)提取液刺激后增殖迅速，肌小管的融合率明顯提高，表明神經(jīng)因素對成肌細(xì)胞的增殖、分化有促進(jìn)作用。為更接近臨床應(yīng)用，組織工程化人工肌肉將逐步從單一肌細(xì)胞三維培養(yǎng)向神經(jīng)、血管與肌肉復(fù)合型的肌組織構(gòu)建過渡。隨著對肌肉損傷修復(fù)過程的分子機(jī)制了

4、解深入，SC被視為重要的影響因素參與到肌肉再生的過程中。然而，雪旺氏細(xì)胞對成肌細(xì)胞的生物學(xué)影響雖已有研究證明，但涉及到的成肌細(xì)胞基因表達(dá)變化尚沒有過多了解。因此深入研究SC對成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化時的基因表達(dá)變化，將促進(jìn)神經(jīng)組織工程的發(fā)展，為復(fù)合型的骨骼肌重建提供理論支持。 本課題立足于實驗室前期的相關(guān)工作：雪旺細(xì)胞培養(yǎng)于與骨骼肌支架相連的管狀支架上，構(gòu)建帶雪旺細(xì)胞索的組織工程化骨骼肌。但成肌細(xì)胞與雪旺細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)的分子機(jī)制不明，限制

5、了該工作的延續(xù)。 本實驗首先獲取原代培養(yǎng)的大鼠雪旺氏細(xì)胞，再與成肌細(xì)胞系L6共培養(yǎng)，通過細(xì)胞計數(shù)及倒置顯微鏡觀察細(xì)胞增殖與分化情況。數(shù)據(jù)顯示與雪旺氏細(xì)胞共培養(yǎng)的成肌細(xì)胞在增殖初期與對照組無明顯差異，至第三天共培養(yǎng)后表現(xiàn)出對數(shù)生長期的時間，明顯早于對照組。處理組的肌管形成率也較對照組為多。肌動蛋白的檢測，在第3天第5天兩個觀察時間點，處理組細(xì)胞已出現(xiàn)高表達(dá)，明顯強(qiáng)于對照組細(xì)胞。以上數(shù)據(jù)說明雪旺氏細(xì)胞的參與能夠有效的促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖

6、及終末分化。 為加深對共培養(yǎng)導(dǎo)致成肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的認(rèn)識，本實驗還采用全基因組基因芯片進(jìn)行檢測，研究SC對成肌細(xì)胞影響過程中的基因譜表達(dá)變化，以明確在誘導(dǎo)分化過程中，涉及到哪些基因的表達(dá)變化以及哪些代謝過程的改變。在處理組與對照組的細(xì)胞所獲RNA質(zhì)量保證的前提下，純化標(biāo)記后與全基因組基因芯片進(jìn)行雜交。雜交后的芯片經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，共篩選出顯著上調(diào)基因12個，顯著下調(diào)基因221個。采用Panther工具對所獲差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果

7、表明與雪旺氏細(xì)胞共培養(yǎng)的成肌細(xì)胞在增殖與分化過程中涉及到多種細(xì)胞內(nèi)代謝過程的改變，差異基因主要與細(xì)胞增殖與分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫與防疫、糖代謝、核酸代謝、以及鈣鐵離子轉(zhuǎn)運等途徑相關(guān)。從而提示上述細(xì)胞內(nèi)代謝過程是雪旺氏共培養(yǎng)影響成肌細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵。而這些代謝過程中涉及到的關(guān)鍵基因的表達(dá)變化則可能是成肌細(xì)胞向終末方向分化的原因所在，針對這些基因的深入探討將有助于深入了解成肌細(xì)胞的終末分化理論，從而為以雪旺氏細(xì)胞和成肌細(xì)胞為基礎(chǔ)的復(fù)合型骨