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文檔簡介
1、目的
通過探討RNAi技術(shù)體外抑制FOXO3a基因表達的效果,從而為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎(chǔ)。
方法
訂購FOXO3a基因的siRNA重組質(zhì)粒,培養(yǎng)大鼠成肌細胞系L6,將FOXO3asiRNA重組質(zhì)粒在Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染,熒光倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),于轉(zhuǎn)染后48h與72h,采用實時定量PCR和Westernblot檢測siRNA重組質(zhì)粒對FOXO3a的m
2、RNA和蛋白質(zhì)水平的抑制效果。
結(jié)果
1、轉(zhuǎn)染后24h,熒光倒置顯微鏡下觀察到細胞中有綠色熒光表達,表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠成肌細胞系L6中。
2、實時定量PCR分析結(jié)果顯示:各干擾序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ在轉(zhuǎn)染后48h對FOXO3a的mRNA的抑制率分別為54%、25%、22%、27%,在mRNA水平均明顯抑制了FOXO3a的表達;各干擾序列FOXO3a-
3、Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ轉(zhuǎn)染后72h對FOXO3a的mRNA的抑制率分別為81%、52%、46%、55%,抑制效應(yīng)更為明顯,抑制效果最為明顯的是FOXO3a-Ⅰ。
3、Western印跡灰度分析結(jié)果顯示:各干擾序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ在轉(zhuǎn)染后48h對FOXO3a蛋白表達的抑制率分別為46%、12%、11%、23%,明顯抑制了FOXO3a的表達;各
4、干擾序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ在轉(zhuǎn)染后72h對FOXO3a蛋白表達的抑制率分別為72%、48%、38%、44%,抑制效應(yīng)更為明顯,與mRNA水平的影響一致。
結(jié)論
1、RNA干擾技術(shù)在體外能夠明顯抑制叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a基因的表達。
2、活體實驗中FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染其干擾序列對FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果尚不明確,這為RNA
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