高脂血癥影響載脂蛋白E基因敲除小鼠對牙齦卟啉單胞菌的先天免疫并促進牙周病進展的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高，高脂血癥對中老年身體健康影響逐漸增大。高脂血癥對全身炎癥和心血管疾病特別是動脈粥樣硬化的影響受到了許多關(guān)注，但是其對牙周病的影響的研究相對較少。
　　載脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein E knock out，ApoE-/-）小鼠在普通飲食下即形成明顯的高脂血癥，既往研究顯示：在脂多糖（lipopolysacchride，LPS）及多種致病菌刺激下，ApoE-/-小鼠比相同基因背景的C57BL/6

2、J野生型（C57 WT）小鼠血液中細胞因子水平升高，疾病進展加快。我們推測長時間高脂血癥也可能促進牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）感染過程中細胞因子的釋放，加速牙周病的進展。
　　在本實驗中，為觀測長時間高脂血癥對牙周病的影響，ApoE-/-及C57 WT小鼠在普通飲食條件下飼養(yǎng)至20 wk。
　　首先，通過結(jié)扎小鼠雙側(cè)上頜第二磨牙，并接種P.gingivalis，

3、建立牙周炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　1）ApoE-/-小鼠在實驗過程中出現(xiàn)明顯的高脂血癥，而體重、血糖等其他身體代謝相關(guān)指標(biāo)未見明顯差異；
　　2）亞甲基藍染色顯示ApoE-/-小鼠比C57 WT小鼠牙槽骨吸收更為嚴(yán)重；
　　3）牙周炎形成過程中，血液中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素（interleukin-6，IL-6）水平，ApoE-/-小鼠低于C57 WT小鼠；

4、
　　4）牙周炎形成過程中，ApoE-/-小鼠牙周清除P.gingivalis能力顯著下降。分析上述結(jié)果，高脂血癥促進牙周病的進展，可能與其降低了機體對P.gingivalis的先天免疫反應(yīng)有關(guān)。
　　接著，為進一步研究先天免疫反應(yīng)的變化，通過腹腔注射P.gingivalis，建立腹腔炎癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　1）細胞因子抗體芯片結(jié)果顯示注射P.gingivalis6h后腹腔液中IL-3、TNF-α和γ干擾素（inte

5、rferon-γ，IFN-γ）等20種細胞因子表達下調(diào)，僅巨噬細胞炎癥蛋白-1-α（macrophage inflammatory protein-1-α，MIP-1-α)和瘦素（leptin）等5種細胞因子表達上調(diào)；
　　2）ELISA檢測結(jié)果顯示在2 h、6 h、12 h和24 h等多個時間點，ApoE-/-小鼠腹腔沖洗液中，IL-1β、TNF-α、IL-6和單核細胞趨化因子（monocyte chemotactic prot

6、ein-1，MCP-1）等促炎細胞因子表達下調(diào)，而抗炎細胞因子IL-10表達未受影響；
　　3）腹腔炎癥形成過程中，ApoE-/-小鼠腹腔清除P.gingivalis的能力也下降。
　　腹腔炎癥模型的結(jié)果進一步驗證了高脂血癥降低了機體對P.gingivalis的先天免疫反應(yīng)，在后續(xù)實驗中對其機制進行了深入研究。
　　在進一步實驗中，分離小鼠腹腔巨噬細胞（peritoneal macrophages，PM），加入P.gi

7、ngivalis刺激。利用小鼠表達譜基因芯片，研究高脂血癥如何影響機體對P.gingivalis的先天免疫；利用real time PCR和ELISA，驗證基因芯片結(jié)果的有效性；采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecepitation,ChIP)，研究高脂血癥對核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）p65結(jié)合至染色質(zhì)DNA動子序列的影響，結(jié)果顯示：
　　1）在未加入P. gingiv

8、alis時，與C57 WT小鼠相比，ApoE-/-小鼠PM中353個基因表達上調(diào)，465個基因下調(diào)表達；經(jīng)P.gingivalis刺激后，148個基因上調(diào)，236個基因下調(diào)；
　　2）基因本體（gene ontology，GO）分析顯示，加入P.gingivalis后，ApoE-/-相對于C57 WT上調(diào)的基因在生物學(xué)過程中與nitrogen compound metabolic process、cell adhesion、mul

9、ticellular organismal development、multicellular organismal development、developmental maturation和anatomical structure development等7項功能相關(guān)；而下調(diào)的基因與生物學(xué)過程中與leukocyte mediated cytotoxicity、regulation of cell killing、positive re

10、gulation of cell killing、immune system process、leukocyte homeostasis、immune effector process等35項功能相關(guān)。
　　3）通路注釋分析（pathway analysis）顯示加入P.gingivalis后，ApoE-/-小鼠與C57 WT相比：
　　a)下調(diào)基因?qū)儆赥oll樣受體（toll like receptor,TLR）通路、JA

11、K-STAT、細胞因子-細胞因子受體和趨化因子信號通路等36條通路（基因富集度P<0.05）
　　b)上調(diào)基因?qū)儆诩毎饣|(zhì)-受體、粘著斑和細胞粘附分子等16條通路；
　　c)屬于TLR通路的差異表達基因有Cd86、Cxcl10、Cxcl9、Ifnb1、Il12a、Il6、Irf7和Stat1等8個，均下調(diào)表達；
　　d)屬于JAK-STAT通路中Ccnd2、Csf2、Csf3、Ifnb1、Ifng、Il12a、Il1

12、5ra、Il6、Socs1和Stat1等10個基因差異表達，且下調(diào)表達；
　　4）real time PCR顯示TNFa、IL6、IL12a和MCP1等表達水平與基因芯片基本一致；
　　5）ELISA顯示高脂血癥降低了PM分泌TNF-α、IL-6和MCP-1的水平；
　　6）ChIP顯示高脂血癥降低了NF-κB p65結(jié)合至TNF-α和IL-10啟動子序列的能力。
　　結(jié)合上述結(jié)果，高脂血癥下調(diào)了ApoE-/-小

13、鼠TLR通路表達，影響了細胞因子分泌和殺滅細菌等生物學(xué)過程，可能與NF-κB p65結(jié)合至染色質(zhì)能力下降相關(guān)。
　　細胞膜上TLR和髓系細胞觸發(fā)受體-1（triggering receptors expressed on myeloid cells-1，TREM-1)等受體的表達，將會直接影響TLR通路介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的強度。為進一步研究TLR通路受損的機制，最后，通過分離小鼠腹腔巨噬細胞，加入P.gingivalis刺激，分析

14、了高脂血癥對巨噬細胞膜表面受體的影響：
　　1）Real time PCR結(jié)果顯示TLR-1、-2、-4和-6、NOD1、NOD、CD14和CD36等20余種膜受體轉(zhuǎn)錄水平未受高脂血癥影響；TREM-1在加入P.gingivalis前后均表達下調(diào)；
　　2）利用流式細胞技術(shù)，驗證蛋白水平表達，發(fā)現(xiàn)TLR-2和-4未受高脂血癥影響，TREM-1表達下調(diào)；
　　3）Western blot結(jié)果顯示高脂血癥降低了巨噬細胞胞內(nèi)

15、誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase，iNOS）水平，減少一氧化氮（nitric oxide，NO）產(chǎn)生，減弱了細胞內(nèi)殺滅細菌的功能；
　　4）TREM-1具有放大TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，采用與TREM-1相同氨基酸序列的LP-17多肽預(yù)刺激RAW264.7細胞系，發(fā)現(xiàn)TREM-1阻斷后，IL-6和TNF-α分泌減少。
　　綜上所述，長時間高脂血癥影響了機體對P.gingivali