磁共振預定位靶向成像技術對荷人結腸癌裸鼠模型成像的實驗研究.pdf

1、目的 1、使用經羥基丁二酰亞胺活化的生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯(biotinl-N-hydroxysuccinimideester,B-NHS)進行單抗CL3的標記，并測定生物素化單抗B-CL3的結合活性、生物素分子偶聯數。 2、以DTPA環(huán)酐法對鏈霉親和素(SA)進行Gd3+的標記，并測定成品SA-DTPA-Gd的SA活性單位、生物素結合特性、標記的Gd3+數目和SA-DTPA-Gd對水分子r1馳豫率影響。

2、3、通過生物素化單抗B-CL3、親和素(Avidin)和SA-DTPA-Gd序貫注射對荷人結腸癌裸鼠模型增強效果的研究，探討生物素和親和素/鏈霉親和素系統(tǒng)(BiotinandAvidin/StrapavidinSystem，BAS)介導的磁共振預定位靶向成像技術對微小腫瘤的診斷價值；通過靜脈和腹腔注射生物素化單抗CL3-B在瘤內形成不同分布模式的鏈霉親和素(SA-DTPA-Gd)結合位點，注射鏈霉親和素(SA-DTPA-Gd)后兩組增強

3、效果的對照研究探討腫瘤內結合位點分布模式對靶向物質在腫瘤內分布的影響。 材料和方法 1.生物素化單克隆抗體的制備。 CL3用0.1mol/L、PH7.4NaHCO3緩沖液稀釋至濃度為1mg/ml；B-NHS用DMSO稀釋成20mg/ml(約58.6mmol/l)。取Cl-3溶液1ml，以摩爾比NHS-Biotin：CL3=20∶1反應，反應時一邊攪拌一邊在抗體溶液中緩慢加入20mg/ml的biotin溶液并充分混

4、合，將此溶液室溫下混合并緩慢攪拌或振蕩.2小時，而后在4℃與0.1mol/L、PH8.0NaHCO3緩沖液透析以除去游離的BNHS。 采用HABA法測定抗體的生物素化程度。將0.1ml，濃度為1mg/ml生物素化的抗體加入1ml的Avidin-HABA，室溫下孵育10min并計算500nm處的吸光值的下降并推算出生物素分子結合數。 CL-3抗體生物素化后抗體活性的測定采用細胞ELISA法。將濃度為1.0×106-7/ml

5、的LoVo細胞以每孔200ul接種于96孔板，4℃過夜培養(yǎng)，待細胞長滿時棄去培養(yǎng)液，Hank，s液洗去殘留培養(yǎng)基。用固定液0.05％戊二醛固定細胞30min，PBS-Twen洗滌5分鐘×3次。加入生物素化CL337℃孵育1.5小時，并設陽性對照(純化CL-3)和空白對照。加入1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，37度反應1.5小時。加鄰苯二胺-雙氧水(OPD-H2O2)底物200ul，37℃閉光反應30min，加NH2SO

6、4終止反應，選取波長490nm，空白調零后測定各孔OD值。根據OD值計算抗體比活性。 2.鏈霉親和素(SA)-DTPA-Gd的制備及其鑒定 由于DTPA環(huán)酐(cDTPA)在水中迅速水解，因而稱取cDTPA35.7mg(0.1mmol)溶于1mlDMSO。稱取1mgSA(約0.0167umol)并加入15ul0.1MNaHCO3緩沖液(PH=8)。將上述15ul的SA溶液與80ul的cDTPA溶液(0.1M)室溫下混合1h

7、后加入1ml0.0069M的GdCl3。在室溫下反應5分鐘后將混合液移入微孔濾膜離心管離心去除未結合的Gd3+離子(5000轉，2次)。然后將溶液定容至約1ml，其中SA濃度為1mg/ml。成品在4℃下保存?zhèn)溆?，使用時以生理鹽水將SA-DTPA-Gd稀釋至相應濃度。 3、CL3-DTPA-Gd的制備 將1mgcDTPA溶于無水二甲亞砜，加入單克隆抗體CL3(2mg，1ml)，cDTPA與單克隆抗體的摩爾比約為30∶1，室

8、溫下孵育45分鐘。完成偶聯反應后再加入GdCl3，絡合反應1分鐘后，用離心超濾法除去游離的Gd3+和DTPA。使用0.1MpH8.0NaHCO3緩沖液將CL3-DTPA-Gd調至0.25mmol/l備用。 4、動物實驗部分 將處于對數生長期的LOVO結腸癌細胞(1×106-7/ml)植入5-7周齡、體重約20～25gBALB/C裸鼠(第一軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)頸背部皮下，4-7周后待腫瘤直徑生長至1cm左右時用于本實

9、驗。 10只荷人結腸癌裸鼠隨機分為2組行單抗直接標記Gd3+的強化研究：B-CL3靜脈注射組和B-CL3腹腔注射組，因而5只裸鼠靜脈注射0.03μmol的CL3-DTPA-Gd(120ul，0.25mM)，5只裸鼠腹腔注射0.03μmol的CL3-DTPA-Gd(120ul，0.25mM)。靜脈預定位組中首先靜脈注射生物素化的CL3(B-CL3)其中7只經尾靜脈注射生物素化的CL3600ug，7只經腹腔注射生物素化的CL3600

10、ug。24小時后14只裸鼠腹腔注射作為追捕劑的親和素80ug，再30min后分別經尾靜脈注射0.01mmol的SA-DTPA-Gd0.2ml。其余6只經尾靜脈注射0.15mmol/l的Gd-DTPA溶液約0.2ml。 采用SiemensMagnetomVision1.5T超導型掃描儀。平掃及增強掃描序列為SET1WI500ms/15ms,T2WI4000ms/98ms.，冠狀位或斜矢狀位。FOV為160×160mm，矩陣256×

11、256，層厚3mm。 單抗直接標記成像研究中于注射CL3-DTPA-Gd后24h進行MR掃描。MR預定位靶向成像的研究中各實驗組在注射對比劑前、后20'、60'、3h、6h、9h、12h和24h分別進行MR掃描。 統(tǒng)計學分析采用軟件SPSS13.0進行。單抗直接標記Gd3+的強化研究中兩組腫瘤強化率差異采用獨立樣本t檢驗；MR預定位成像中不同組間信號強度差異采用重復測量的方差分析(RepeatMearsuresANOVA

12、)；不同組間腫瘤和肝臟峰值強化率采用單因素方差分析(One-wayANOVA)；B-CL3靜脈預定位組和腹腔預定位組間強化均勻性分析采用兩獨立樣本非參數檢驗；P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。 結果 1.單克隆抗體CL3經與活性生物素酯NHS-B反應，每個抗體分子平均可結合3.5個分子的生物素，其抗體結合活性約為93.6％。 2.SA-DTPA-Gd溶液中加入0.1ug/ul的生物素共40ul后OD233值達到飽和

13、，SA-DTPA-Gd的SA活性為13.3。每分子SA-DTPA-Gd可結合4個生物素分子；SA-DTPA-Gd復合物中SA分子與Gd離子數目比約為1∶13.3。室溫下SA-DTPA-Gd溶液的r1馳豫率為8.10，而相同濃度下Gd-DTPA溶液r1馳豫率為4.49。 3.CL3-DTPA-Gd靜脈和腹腔注射組24小時后的腫瘤強化程度并無顯著性差異。然而兩組中瘤內滲透曲線具有不同的形態(tài)：靜脈注射組中腫瘤由表面至中央的光密度基本均

14、勻一致，而腹腔注射組中腫瘤邊緣光密度值較高，向腫瘤中心則光密度逐漸下降。 4.生物素化單抗BCL3靜脈預定位組在SA-DTPA-Gd靜脈注射后腫瘤組織早期為逐漸強化，信號逐漸上升，至6h腫瘤信號達到最高，信號強度達622.9±23.2，強化率為74.8±5.5％，并與其他時間點均具有顯著統(tǒng)計學差異；掃描延遲至24h仍可見腫瘤組織明顯強化，信號強度達518.8±20.7，強化率為45.6％±2.9％。 5.各組中腫瘤和肝臟

15、峰值強化率的比較 各組中腫瘤和肝臟峰值強化率的比較顯示CL3靜脈預定位組和CL3腹腔預定位組中腫瘤組織均于第6小時達到峰值強化，而Gd-DTPA組中20分鐘時腫瘤信號強度最高。單因素方差分析多重比較顯示Gd-DTPA組峰值強化率高于其余兩組并具有顯著性差異，而CL3靜脈預定位組雖然腫瘤峰值強化的信號增加值和強化率均高于CL3腹腔預定位組，但兩組間無顯著性差異。 6.SA-DTPA-Gd靜脈注射后各組中腫瘤強化均勻性比較：

16、 SA-DTPA-Gd靜脈注射后各組中腫瘤強化均勻性比較顯示20min時CL3靜脈組和腹腔注射組中分別有2枚和3枚腫瘤判斷為無強化，因而未參加均勻性比較；CL3靜脈預定位組在SA-DTPA-Gd靜脈注射后6小時4個樣本為均勻強化，3個為彌漫不均勻強化，而CL3靜脈組中僅有3枚為彌漫不均勻強化，兩者具有顯著統(tǒng)計學差異；9小時、12小時和24小時后CL3靜脈組均有5個以上樣本為均勻強化，而CL3腹腔組中僅在24小時有3個樣本為均勻強

17、化，其余均為彌漫不均勻強化和環(huán)型強化，兩組間具有顯著統(tǒng)計學差異；其余時間點(1、3小時)兩組的強化均勻度均無顯著統(tǒng)計學差異。 結論 1.單克隆抗體CL3在結合3.5個生物素分子后，仍可保持較高的抗原結合活性。 2.在PH=8，SA和cDTPA摩爾比為1∶500時使用DTPA環(huán)酐法可在SA上結合14-15個Gd3+，合成的SA-DTPA-Gd的生物素活性單位為13.3；SA-DTPA-Gd體外r1馳預率為18.1，