烏頭堿和新烏頭堿致心律失常作用比較及其細(xì)胞學(xué)機(jī)制.pdf

1、烏頭類(lèi)中藥屬于毛茛科植物，在我國(guó)使用已有2000多年的歷史。其植物主根為烏頭，側(cè)根為附子，獨(dú)根為天雄，均可入藥，是臨床常用的祛風(fēng)散寒、除痹止痛之品。其中附子有回陽(yáng)救逆之功效，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用于救治急性心肌梗塞所致的休克、低血壓狀態(tài)、冠心病、風(fēng)心病和多種疑難疾病，在救治冠心病、風(fēng)心病和低血壓等方面均表現(xiàn)出良好的治療效果，烏頭類(lèi)生物堿為其有毒的成分。因此，烏頭的顯著療效與毒性作用并存。其毒性主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，而對(duì)心臟的毒性

2、最為明顯。可出現(xiàn)多形性心律失常，如單源室性早搏、單源多形室性早搏、室速及室顫，病人常因心律失常及呼吸中樞麻痹死亡。對(duì)烏頭中毒患者的血液學(xué)分析表明，其主要毒性成分為烏頭堿(ACO)、新烏頭堿(MACO)等。ACO是目前常用的制備心律失常的工具藥，常用于抗心律失常藥物的機(jī)制研究。MACO是ACO的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，共同擁有C19母核結(jié)構(gòu)，但其是否具有致心律失常的毒性作用尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其作用機(jī)制更是鮮有研究。
　　 心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生是

3、細(xì)胞膜多種離子通道共同作用的結(jié)果，細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)失衡可導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。一般認(rèn)為，ACO的致心律失常作用和其促進(jìn)鈉離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度([Na+]i)增加，通過(guò)生電性的鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger)伎細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。此外，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)ACO對(duì)L-型鈣通道、HERG和Ikur通道也有不同程度的抑制作用。ACO對(duì)以上離子通道共同作用的結(jié)果，可能使APD延長(zhǎng)，進(jìn)而出

4、現(xiàn)遲后除極(DAD)和觸發(fā)活動(dòng)(TA)。然而，研究發(fā)現(xiàn)，ACO在細(xì)胞外液低鈣條件下，可縮短APD并誘發(fā)DAD和TA。由此可以認(rèn)為，ACO誘發(fā)的心律失常和APD的改變有關(guān)，APD延長(zhǎng)或縮短可能和所選用的細(xì)胞外液及動(dòng)物種屬有關(guān)。采用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)，在豚鼠乳頭肌的動(dòng)作電位記錄中，我們也發(fā)現(xiàn)，ACO可通過(guò)縮短APD誘發(fā)DAD的產(chǎn)生，而這一點(diǎn)不能單純用Na+電流興奮來(lái)解釋。Na+/K+泵可通過(guò)消耗ATP，將動(dòng)作電位期間細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的Na+泵出細(xì)胞

5、外，維持細(xì)胞靜息膜電位的穩(wěn)定，并保持細(xì)胞的興奮性。ACO對(duì)中樞的Na+/K+泵有明顯的抑制作用，但其對(duì)心臟的Na+/K+泵是否有抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 綜合以上所述，ACO所致的心律失常不能單純用促進(jìn)Na+電流或抑制Ca2+及K+電流來(lái)解釋?zhuān)琈ACO是否具有致心律失常作用及其致心律失常的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，在本次研究中我們擬采用整體動(dòng)物模型，觀察并比較ACO和MACO的致心律失常作用，并在細(xì)胞和離子通道水平對(duì)其致心律失常的

6、機(jī)制進(jìn)行分析。該研究可豐富ACO和MACO的致心律失常理論，為臨床避免和降低其毒副作用提供理論基礎(chǔ);另外，還可以為藥理實(shí)驗(yàn)中選擇心律失常模型提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 第一部分ACO和MACO對(duì)豚鼠心電圖的影響
　　 目的:觀察ACO和MACO對(duì)豚鼠整體心電圖的影響，并對(duì)二者出現(xiàn)的心律失常類(lèi)型及嚴(yán)重程度進(jìn)行對(duì)比分析。
　　 方法:選取體重在300-350g的雄性健康豚鼠25只，隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組（5只）、ACO25μg

7、/Kg組（10只）和MACO25μg/Kg組(10只)。將豚鼠稱(chēng)重，用1.2％的戊巴比妥鈉(0.3ml/100g)麻醉后固定。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別股靜脈注射ACO或MACO，注射劑量均為25μg/Kg，對(duì)照組靜脈給予等容積的生理鹽水。用RM6240CD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥前后ECG的變化，最長(zhǎng)記錄120min。
　　 結(jié)果:對(duì)照組動(dòng)物連續(xù)記錄120min，心電圖未見(jiàn)明顯異常。ACO組給藥前及給藥后20min內(nèi)

8、豚鼠的心電圖未見(jiàn)明顯異常，在22.75±5.70min時(shí)出現(xiàn)室性早搏(8/10)，在27.75±13.0min時(shí)發(fā)生房室傳導(dǎo)阻滯(5/10)，在42.30±15.69min時(shí)發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速(5/10)，在39.65±7.17min時(shí)發(fā)生室顫(3/10)，在56.32±11.40時(shí)有40％動(dòng)物死亡。MACO組動(dòng)物在給藥后1.46±0.66min時(shí)即發(fā)生室性早搏(9/10)，在1.46±0.66min時(shí)發(fā)生房室傳導(dǎo)阻滯(7/10)，2.5

9、3±0.87min時(shí)發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速(9/10)，在3.51±1.19min時(shí)發(fā)生室顫(9/10)，在23.1±14.92min時(shí)動(dòng)物全部死亡。MACO組豚鼠發(fā)生室性早搏、房室傳導(dǎo)阻滯、室性心動(dòng)過(guò)速及室顫的時(shí)間均明顯早于ACO組（P均＜0.05），且室顫及死亡發(fā)生率明顯高于ACO組（P均＜0.05）。
　　 結(jié)論:ACO和MACO均可使豚鼠誘發(fā)心律失常，且其二者誘發(fā)心律失常的類(lèi)型基本相同。在同等劑量下，MACO誘發(fā)的心律失常發(fā)生

10、時(shí)間明顯早于ACO及動(dòng)物死亡率高于ACO。
　　 第二部分ACO和MACO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響和機(jī)制分析
　　 目的:觀察ACO和MACO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響，并分析其作用機(jī)制。
　　 方法:急性分離豚鼠心室肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù)，在電流鉗的模式下記錄:(1)ACO和MACO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。(2)在非特異性和特異性Na+/K+泵抑制劑偏釩酸鈉(SMV)、哇巴因(OUA

11、)存在的條件下，記錄ACO和MACO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。(3)在特異性Na+通道抑制劑河豚毒素(TTX)存在的條件下，觀察ACO和MACO對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。
　　 結(jié)果:(1)10-7MACO對(duì)AP的各項(xiàng)參數(shù)均未見(jiàn)明顯影響。ACO3×10-7M和3×10-6M均能縮短APD30和APD90。此外，3×10-6M尚可使RMP和APA明顯減小，并出現(xiàn)DAD和TA。而MACO10-7M和3×10-7M亦能縮短

12、APD30和APD90。此外，3×10-7M尚可使RMP和APA明顯減小，并出現(xiàn)EAD、DAD和TA。(2)在SMV(10-3M)存在的情況下，ACO(3×10-7M)對(duì)APD30和APD90未見(jiàn)明顯縮短作用，但對(duì)高濃度的ACO(3×10-6M)所致的DAD和TA無(wú)明顯影響;另外，SMV(10-3M)消除了高濃度的ACO(3×10-6M)對(duì)RMP,APA的影響。SMV(10-3M)不能夠抑制MACO對(duì)APD30，APD90的影響，但能夠

13、消除的高濃度的MACO(3×10-7M)對(duì)RMP,APA的影響，對(duì)DAD，EAD，TA的發(fā)生無(wú)明顯影響。OUA(10-7M)能夠明顯縮短APD30，APD90，抑制低濃度ACO(3×10-7M)縮短APD30，APD90的作用，消除高濃度的ACO（3×10-6M）對(duì)RMP,APA的影響，對(duì)DAD和TA的發(fā)生無(wú)明顯影響。OUA僅能夠消除高濃度的MACO(3×10-7M)對(duì)RMP,APA的影響。(3)TTX(2×10-6M)能使RMP水平明

14、顯下移，對(duì)動(dòng)作電位其它參數(shù)無(wú)明顯影響;在TTX存在的條件下，高濃度的ACO（3×10-6M）僅能夠使APD30，APD90明顯縮短，但無(wú)DAD，TA發(fā)生，低濃度ACO對(duì)動(dòng)作電位的作用被完全消除。低濃度的MACO(10-7M)對(duì)動(dòng)作電位的作用被完全消除，高濃度的MACO(3×10-7M)能夠明顯縮短APD30，APD90，但僅能誘發(fā)出EAD且發(fā)生率明顯降低。
　　 結(jié)論:1.ACO和MACO均可通過(guò)縮短APD誘發(fā)DAD和TA，MA

15、CO尚誘發(fā)EAD;在同一濃度下，MACO較ACO更容易誘發(fā)心肌細(xì)胞的電生理活動(dòng)異常。
　　 2.ACO可通過(guò)抑制Na+/K+泵及興奮Na+通道電流而影響動(dòng)作電位，而MACO主要通過(guò)興奮Na+通道電流而影響動(dòng)作電位。
　　 第三部分ACO和MACO對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞Na+/K+泵電流（INa/K）和Na+通道電流的影響(INa)
　　 目的:研究ACO和MACO對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞INa/K和INa的影響。
　　 方

16、法:利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，通過(guò)負(fù)壓吸破細(xì)胞膜的方法建立全細(xì)胞記錄，在電壓鉗模式下:(1)鑒定INa/K的電生理學(xué)特征。(2)分別記錄ACO和MACO對(duì)INa/K的影響。(3)分別記錄ACO和MACO對(duì)INa的影響。
　　 結(jié)果:(1)在我們的實(shí)驗(yàn)條件下記錄出的INa/K符合豚鼠心室肌細(xì)胞INa/K的電生理學(xué)特征。(2)ACO能夠濃度依賴(lài)性的抑制INa/K，ACO(3×10-7M)可抑制INa/K26.8±4.46％，ACO(3×

17、10-6M)可抑制INa/K48.6±14.6％;MACO能夠濃度依賴(lài)性的抑制INa/K，MACO(10-7M)可抑制INa/K28.0±7.5％，MACO(3×10-7M)可抑制INa/K41.8±9.3％。相同濃度下，MACO對(duì)INa/K的抑制作用強(qiáng)于ACO(P＜0.05)。(3)ACO能夠濃度依賴(lài)性的激動(dòng)INa，低濃度的ACO(3×10-7M)能使INa增加25.5±9.2％，高濃度的ACO(3×10-6M)能使INa增加37.2