丙泊酚對(duì)LPS介導(dǎo)的人離體嗜中性白細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響.pdf

1、目的：
　　嗜中性白細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)中起著十分重要的作用。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通過激活TLR4(Toll like receptor)信號(hào)通道影響嗜中性白細(xì)胞的遷移、呼吸爆發(fā)、激活、調(diào)亡、生存和調(diào)亡。LPS活化嗜中性白細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶產(chǎn)生氧自由基，主要通過MyD88依賴型途徑和MyD88非依賴型途徑。其中絲裂霉素激酶(mitogen-activated protein kinas

2、e，MAPK)是上述兩通道的共同途徑之一。丙泊酚為臨床常用的靜脈麻醉劑，近來發(fā)現(xiàn)丙泊酚還具有抗氧化作用和抗炎特性。許多研究表明丙泊酚可下調(diào)LPS介導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞TLR4表達(dá)。但丙泊酚調(diào)節(jié)嗜中性白細(xì)胞的機(jī)制并不清楚。本研究觀察丙泊酚對(duì)人嗜中性白細(xì)胞MyD88以及其下游因子TRAF6，TRAF3和p38MAPK表達(dá)的影響，以期待論證丙泊酚抗炎的機(jī)制。
　　方法：
　　獲得院倫理委員會(huì)和志愿者知情同意后，從10名不吸煙健康志愿者

3、抽取外周靜脈血20ml，立即置于葡聚糖沉淀(密度為1.077g/ml)的肝素化試管中，緩慢搖勻。然后離心200×g分離10min。去掉血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層和紅細(xì)胞，并用PBS洗滌3遍。離心200×g分離10min。去掉上清，反復(fù)3次。將分離的人嗜中性白細(xì)胞(5×107)置于PMI1640培養(yǎng)基重懸，離心洗滌。用流式細(xì)胞儀分析CD16-PE和CD66b-FITC標(biāo)記的人嗜中性白細(xì)胞純度，為99％。細(xì)胞用于以下分析:①用流式細(xì)胞儀分析LPS

4、介導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平和丙泊酚的影響。將嗜中性白細(xì)胞(3×106 cells)置于10μM CM-H2DCFDA的無胎牛血清的培養(yǎng)液中30min，然后用LPS（終濃度為1μg/ml）和不同濃度的丙泊酚((10，50，100，150μM)）刺激10min。用流式細(xì)胞儀通過計(jì)算二氯二乙酸酯氧化的百分率檢測ROS水平。②用Western blot法檢測嗜中性白細(xì)胞MyD88、 TRAF6、TRAF3和p38MAPK表達(dá)。將嗜中性白細(xì)

5、胞(3×106 cells)置于細(xì)胞裂解液中。用LPS（終濃度為1μg/ml）和不同濃度的丙泊酚（10，50，100，150μM）刺激10min，各組樣本分別加入10％SDS-PAGE電泳分離膠中。然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用封閉液室溫下處理細(xì)胞2hr。最后加入一抗（緩沖液含有5％ BSA，1XTBS，0.1％Tween-20;濃度比為1∶1000）4℃過夜。然后將PVDF膜洗滌2次，各5min，加入二抗（濃度1∶500）室溫孵育2h。用E

6、CL發(fā)光液進(jìn)行成像。
　　結(jié)果：
　　人嗜中性白細(xì)胞(5×105 cells/well)用純化LPS(1μg/mL)和相應(yīng)濃度的丙泊酚(10，50，100，150μM)進(jìn)行孵育10min，通過流式細(xì)胞儀檢測產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙泊酚呈濃度依賴性抑制LPS介導(dǎo)的人嗜中性白細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。丙泊酚（10μM和50μM）抑制程度分別為89.58±6.67％ or73.69±6.33％，明顯低于單純LPS組(P＜0.05

7、)，隨著濃度的增加（100μM和150μM），其抑制程度分別為65.61±4.67％ or60.0±8.50％，(P＜0.01)。人嗜中性白細(xì)胞(5×105cells/well)用純化LPS(1μg/mL)和相應(yīng)濃度的丙泊酚(10，50，100，150μM)進(jìn)行孵育10min，用Western blot法檢測嗜中性白細(xì)胞MyD88、 TRAF6、TRAF3和p38MAPK水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙泊酚呈濃度依賴性抑制LPS介導(dǎo)人嗜中性白細(xì)胞MyD