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文檔簡介
1、目的:人類的生殖活動受內(nèi)分泌調節(jié)和免疫調節(jié)。月經(jīng)病寒凝血瘀證可表現(xiàn)為月經(jīng)過少、月經(jīng)后期及閉經(jīng)等內(nèi)分泌失調疾病。本試驗通過分析寒凝血瘀證模型大鼠血清和卵巢組織細胞因子的變化與卵巢功能的關系,揭示寒凝血瘀證婦科病的部分發(fā)病機理,探討加減溫經(jīng)湯的干預調節(jié)機制,為中醫(yī)婦科證候研究提供理論和實驗依據(jù)。 方法:選用動情周期正常(4~5天)的健康清潔級SD雌性大鼠60只,鼠齡3個月,體重230±20g,隨機分為6組,每組10只:即正常對照組(
2、簡稱為“正常組”),模型對照組(簡稱為“模型組”),模型加加減溫經(jīng)湯低劑量組(簡稱為“低劑量組”),模型加加減溫經(jīng)湯中劑量組(簡稱為“中劑量組”),模型加加減溫經(jīng)湯高劑量組(簡稱為“高劑量組”,低劑量組、中劑量組、高劑量組又合稱為“治療組”),桃紅四物湯組(簡稱為“對照組”)。正常組常規(guī)飼養(yǎng),模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠置于0℃~1℃冰水中20分鐘,每日一次,連續(xù)兩周。低劑量組、中劑量組、高劑量組于造模的第一天開始,
3、分別按7.33g、14.66g、29.32g/kg/日(分別相當于臨床成人劑量的5倍、10倍、20倍)給予加減溫經(jīng)湯灌胃,每日一次,連用兩周;對照組按10.83g/kg/日(相當于臨床成人劑量的10倍)給予桃紅四物湯灌胃,其它兩組給予同體積的蒸餾水。自造模第一天起,每日定時進行陰道涂片,觀察大鼠動情周期變化。末次造模給藥后,禁食8小時,選擇動情間期的大鼠斷頭取血,制備血清,放免法檢測雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)、卵泡刺激素(F
4、SH)、黃體生成素(LH)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。無菌操作剖腹取出同一側卵巢組織,吸去血跡,稱重后置于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋,5μm厚連續(xù)切片,進行免疫組織化學染色,觀察卵巢組織白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)表達強度。 結果: 1大鼠動情周期的變化 模型組大鼠動情周期延長、間期延長,與正常組比
5、較有顯著性差異(均P<0.01),經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療,中、高劑量組動情周期縮短,與模型組比較有顯著性差異(P<0.01,P<0.01);對照組與模型組比較動情周期縮短,但其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各治療組和對照組動情間期皆縮短,與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01P<0.01,P<0.05),與正常組之間比較無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。 2血清生殖激素變化 與正常組相比,模型組血清E2、
6、P、T、FSH、LH均顯著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療后,低劑量組E2有升高趨勢,但與模型組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),中、高劑量組和對照組E2升高,有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。各治療組和對照組P水平升高,與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。各治療組和對照組的T和FSH水平均高于模型組,
7、除高劑量組外,其余各組與模型組比較均無顯著性差異。高、中、低劑量組和對照組LH升高,與模型組比較均有顯著性差異(均P<0.01),其中高、中劑量組和對照組與正常組之間無顯著性差異(P>0.05)。 3血清IL-1β、TNF-α結果 與正常組相比,模型組血清IL-1β降低,TNF-α升高(均P<0.01)。與模型組比較,加減溫經(jīng)湯中、高劑量組IL-1β升高(均P<0.01)、TNF-α降低(P<0.05,P<0.01)。低
8、劑量組IL-1β有升高趨勢、TNF-α有降低趨勢,但與模型組比較均無顯著性差異(P>0.05)。對照組TNF-α水平降低,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),IL-1β有升高趨勢,與模型組比較無顯著性差異(P>0.05)。 4卵巢組織IL-β、TNF-α、NF-κBP65的表達 4.1卵巢組織IL-1β蛋白的表達情況 IL-1β陽性表達定位于細胞漿內(nèi),為棕黃色染色。在大鼠卵巢顆粒細胞、黃體細胞、卵泡液中均有
9、表達,在髓質血管周圍有少量表達。與正常組相比,模型組大鼠卵巢中IL-1β表達增強(P<0.01),灌服加減溫經(jīng)湯后,中、高劑量組IL-1β表達均低于模型組(P<0.01,P<0.01),且中、高劑量組二者之間比較無顯著性差異(P>0.05)。低劑量組和對照組IL-1β表達與模型組比較雖有減少趨勢,但無顯著性差異(P>0.05)。高劑量組IL-1β表達水平低于低劑量組和對照組(P<0.05,P<0.05)。中、高劑量組與正常組比較無顯著性
10、差異(均P>0.05)。 4.2卵巢組織TNF-α蛋白的表達情況 TNF-α陽性表達定位于細胞漿內(nèi),在大鼠黃體細胞、顆粒細胞、膜—間質細胞、髓質中均有表達。模型組TNF-α表達增多,與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)。低、中、高劑量組與對照組TNF-α表達均低于模型組(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01),低劑量組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。高劑量組TNF-α表達低于低劑量組和對照
11、組,差異有顯著性(均P<0.05);高劑量組與正常組比較無顯著性差異(P>0.05)。 4.3卵巢組織NF-κBP65蛋白的表達情況 NF-κBP65蛋白陽性染色定位于胞漿和胞核內(nèi),主要分布于顆粒細胞、髓質血管和黃體細胞內(nèi)。正常組大鼠NF-κB表達較少,多局限于胞漿,偶見細胞核陽性。模型組NF-κB多表達于胞核,其灰度值與正常組比較顯著降低(P<0.01),說明NF-KB的表達較正常組增多。低劑量組NF-κB的表達量稍有
12、下降,與模型組比較無顯著性差異(P>0.05);中、高劑量組和對照組NF-κB的表達與模型組比較均降低,差異有顯著性(P<0.01,P<0.01,P<0.05),其中中、高劑量組的表達低于低劑量組和對照組(均P<0.05),低劑量組和對照組NF-κB表達均高于正常組,差異有顯著性(P<0.01,P<0.01)。中、高劑量組與正常組比較無顯著性差異。(均P>0.05) 5卵巢組織IL-β、TNF-α表達與NF-κB活性相關性分析
13、 卵巢組織IL-β、TNF-α與NF-κB活性呈正相關(r=0.523,P<0.01;r=0.662,P<0.01)。 結論: 1寒凝血瘀證模型大鼠血清生殖激素水平低下,卵巢局部IL-1β,TNF-α含量增加,提示細胞因子的異常改變可能是導致卵巢功能紊亂的重要因素。 2寒凝血瘀證模型大鼠卵巢內(nèi)NF-κB的活化增強,與IL-1β,TNF-α的蛋白表達顯著正相關,提示卵巢內(nèi)NF-κB在寒凝血瘀狀態(tài)下可被某些因素
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