誘導(dǎo)重癥肌無(wú)力模型新方法并研究可溶性促衰變因子對(duì)其的保護(hù)作用.pdf

1、因?qū)嶒?yàn)性自身免疫重癥肌無(wú)力（EAMG)動(dòng)物模型其發(fā)病特點(diǎn)與重癥肌無(wú)力(MG)患者相似,故一直以來(lái)成為 MG病因病理及治療研究的媒介,也正是有了EAMG,使得MG的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。常用的誘導(dǎo)EAMG模型的方法有主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫。以往學(xué)者通常用MG患者血清被動(dòng)免疫EAMG,用人肌肉乙酰膽堿受體(AChR)或電鰩電器官中的AChR作為免疫原主動(dòng)免疫EAMG。但與被動(dòng)免疫相比,主動(dòng)免疫的EAMG其T、B細(xì)胞免疫反應(yīng)特點(diǎn)更符合MG發(fā)病

2、特點(diǎn),所以大多數(shù)研究仍采用主動(dòng)免疫來(lái)制備 EAMG。但是電鰩獲取不易且價(jià)格昂貴,提取過程中需使用α-銀環(huán)蛇毒等昂貴的試劑,給EAMG的制作增加了難度;而人肌肉獲取也相對(duì)不易,且肌肉中的AChR一旦離體便會(huì)很快降解,而且提取量也較少,所以需要尋找一種便捷的方法誘導(dǎo)EAMG。
　　既然天然的AChR不易獲得,那么我們可以人工合成獲取AChR去免疫動(dòng)物。若取AChR全長(zhǎng)序列表達(dá)蛋白,蛋白分子量大,給基因表達(dá)、轉(zhuǎn)化和蛋白表達(dá)技術(shù)操作上帶來(lái)

3、很多不便,特別是會(huì)發(fā)生基因突變?cè)斐杀磉_(dá)的蛋白不具有抗原性。
　　參照研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)AChR的自身抗體(Ab)在MG發(fā)生上起了決定性作用,而其抗體的產(chǎn)生主要是針對(duì)AChRα亞基N末端胞外域ECD(α1-210)的。因?yàn)樵贓CD上有主要免疫原區(qū)(MIR)和特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞表位,還有AChR結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)自身抗體產(chǎn)生后與ECD上AChR結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,使AChR失活,同時(shí)刺激特異性T細(xì)胞增殖,補(bǔ)體系統(tǒng)激活,最終引發(fā)MG發(fā)生。所以在EAMG

4、模型制備中,可以考慮用該片段誘導(dǎo)動(dòng)物。
　　研究發(fā)現(xiàn)起源于人神經(jīng)髓母細(xì)胞瘤的TE671細(xì)胞中的AChR(AChRTE)也能夠和人肌肉AChR(AChRMU)單克隆抗體(mAbs)發(fā)生反應(yīng),包括針對(duì)AChR ECD區(qū)和MIR區(qū)的mAbs。所以用AChRTE重組表達(dá)AChRMUα亞基ECD蛋白是可行的。本實(shí)驗(yàn)充分采用了如RT-PCR,載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化,蛋白在大腸桿菌中的表達(dá),液相色譜等技術(shù)得到了高度純化的ECD蛋白,并免疫Lewis大鼠

5、制作EAMG。再將純化提取的大鼠可溶性促衰變因子(rDAF)靜脈注射入EAMG模型中,評(píng)估其在血漿中代謝情況,研究其對(duì)MG的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)測(cè)序證明PCR克隆出的ECD核苷酸序列,同人類基因庫(kù)中的完全一致,成功插入到載體pET16b后,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。之后用SDS-PAGE法印證了得到的包涵體蛋白正是目的蛋白。經(jīng)透析復(fù)性后,ECD蛋白能夠和mAb35結(jié)合,證明蛋白具有活性。將得到的可溶性ECD蛋白免疫大鼠,得到了