HLA-E基因RNA干擾和過表達(dá)在肝癌細(xì)胞Bel7402中對(duì)NK細(xì)胞免疫監(jiān)視功能的影響.pdf

1、研究背景: 腫瘤免疫中，機(jī)體的細(xì)胞免疫起主要作用，NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)是機(jī)體抵抗腫瘤生長(zhǎng)和病毒感染的重要免疫效應(yīng)細(xì)胞。 T淋巴細(xì)胞是腫瘤特異性、并受HLA-I分子限制，其免疫啟動(dòng)是癌細(xì)胞HLA-I分子向T淋巴細(xì)胞TCR遞呈免疫原性多肽。癌細(xì)胞表面經(jīng)典HLA—I分子的丟失是腫瘤生物學(xué)中一個(gè)普遍現(xiàn)象，這正是腫瘤針對(duì)T淋巴細(xì)胞采取的一種主要逃逸機(jī)制。 NK細(xì)胞不同于CTL，其能識(shí)別腫瘤細(xì)胞HLA-I類

2、分子表達(dá)的變異、下降或缺如，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷。 HLA—E是功能和作用途徑最為明確的主要非經(jīng)典HLA-I類分子。HLA—E對(duì)NK細(xì)胞的作用可能是雙重的，即抑制或活化，其效應(yīng)與‘NK細(xì)胞表面的受體類型有關(guān)。 抑制性受體保護(hù)表達(dá)HLA-I類分子的正常細(xì)胞免受NK細(xì)胞的攻擊，而當(dāng)靶細(xì)胞表面HLA-I類分子表達(dá)降低、丟失或發(fā)變異時(shí)，NK細(xì)胞才能活化并啟動(dòng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，此即NK細(xì)胞的"missing self"識(shí)別模式。

3、 目的: 在mRNA和蛋白水平上，研究HLA-E在胎肝細(xì)胞系和五種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其可能地位；通過RNAi技術(shù)，下調(diào)肝癌Bel7402細(xì)胞的HLA-E基因表達(dá)，研究NK細(xì)胞對(duì)其殺傷作用的影響；通過慢病毒載體攜帶HLA-E基因過表達(dá)，使肝癌Bel7402細(xì)胞的HLA-E基因上調(diào)，以研究其對(duì)NK細(xì)胞腫瘤殺傷作用的影響。通過上述兩種技術(shù)，探討HLA-E基因在NK介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視中的作用。 方法: 通

4、過RT-PCR、Western Blot技術(shù)研究五種肝癌細(xì)胞系和胎肝細(xì)胞系中HLA-E mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況；構(gòu)建pGCsi-U6／Neo／GFP／HLA-E和LentiVims／CMV／GFP—HLA—E重組慢病毒載體；分別轉(zhuǎn)染或感染Bel7402細(xì)胞，觀察NK細(xì)胞對(duì)Bel7402的免疫監(jiān)視作用。 結(jié)果: 1、Real Time PCR檢測(cè)顯示，HepG2細(xì)胞、Bel7402細(xì)胞、PLC細(xì)胞、MHCC97細(xì)

5、胞、Hep382.1-7細(xì)胞與L02細(xì)胞在HLA-E mRNA水平比較，除Hep382.1-7細(xì)胞表達(dá)幾乎接近缺失外，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異(P>0.05)。Western Blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞、Bel7402細(xì)胞、PLC細(xì)胞、MHCC97細(xì)胞、Hep382.1-7細(xì)胞與LO2細(xì)胞在HLA-E蛋白水平比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.01)，其中Hep382.1-7細(xì)胞表達(dá)缺失。 2、Real Time PCR結(jié)果顯示，NC、H

6、LA-E1、HLA-E2、HLA-E3、HLA—E4組mRNA水平的抑制率分別為10.5％、55.5％、34.O％、73.0％、30.7％：Westem Blot 結(jié)果顯示，NC、HLA-E1、HLA．E2、HLA．E3、HLA．E4組蛋白水平的抑制率分別為15％、62.7％、60.5％、73.6％、51.7％。 3、Lentivirus／CMV／GFP-HLA-E重組慢病毒載體感染Bel7402細(xì)胞后，在mRNA水平和蛋白水平

7、與Bel7402對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異(P<0.01)。 4、未封閉組：Bel7402組和Bel7402 HLA—E3組、Bel7402 Lenti HLA-E組比較，NK細(xì)胞的殺瘤活性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中HLA-E基因RNA干擾組和未干擾組具有顯著性差異(P<0.01)． 5、封閉組和未封閉組比較，NK細(xì)胞的殺瘤活性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論: 1、肝癌細(xì)胞系

8、(HepG2、Bel7402、PLC、MHCC97、Hep382.1-7)與胎肝細(xì)胞系(LO2)比較，HLA基因在mRNA水平，除Hep382.1-7細(xì)胞表達(dá)幾乎接近缺失外，其它細(xì)胞表達(dá)無明顯的差異；在蛋白水平上，肝癌細(xì)胞系普遍表達(dá)較低，Hep382.1-7細(xì)胞表達(dá)缺失； 2、成功構(gòu)建pGCsi-U6／Neo／GFP／HLA-E載體，在mRNA水平和蛋白水平有效抑制效率分別為73.0％和73.6％； 3、成功構(gòu)