小麥葉片中潛伏侵染白粉菌的Nested PCR檢測.pdf

1、小麥白粉病是小麥生產(chǎn)上的主要病害之一,病害流行的預(yù)測預(yù)報和風(fēng)險估計是綜合防治的重要部分.盡早、準(zhǔn)確地估計病害發(fā)生趨勢是有效的預(yù)測預(yù)報的關(guān)鍵.雖然我國小麥白粉病發(fā)生規(guī)律因地區(qū)和氣候條件而異,但對越冬麥苗和越夏自生麥苗的潛育侵染程度做及時、準(zhǔn)確的監(jiān)測成為不同地區(qū)病害預(yù)測預(yù)報和風(fēng)險估計中普遍存在的關(guān)鍵環(huán)節(jié).而這方面的進展受到傳統(tǒng)、落后方法的制約,如葉片或幼苗取樣培養(yǎng)的方法耽工、費時、靈敏性差.快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)顯示了有效改進流行學(xué)方法的

2、巨大潛力.本研究應(yīng)用分子生物學(xué)原理、技術(shù)和方法探討準(zhǔn)確、快速地測定小麥白粉病潛育侵染的新方法,為改進流行學(xué)的傳統(tǒng)監(jiān)測方法奠定了基礎(chǔ). 本研究根據(jù)小麥白粉菌 (Blumeria graminis f.sp.tritici) 核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS) 序列設(shè)計合成常規(guī)PCR 引物F1/R1、F2/R1、F3/R1.應(yīng)用小麥其它病原真菌做參照,表明所設(shè)計的三對引物均對小麥白粉菌有特異性,能區(qū)分小麥白粉菌和其它麥類病害.其中F1/

3、R1較F2/R1、F3/R1靈敏性更高,可檢測到1pg白粉菌DNA.在篩選獲得的特異性引物F1/R1所擴增產(chǎn)物的序列基礎(chǔ)上,設(shè)計合成了Nested-PCR 內(nèi)外引物,并對其進行靈敏性測定.應(yīng)用所設(shè)計的Nested-PCR流程,從純培養(yǎng)的病原菌中可檢測到的最低病菌DNA含量為0.1fg. 本研究建立了從小麥病葉中提取白粉菌DNA的技術(shù).應(yīng)用常規(guī)PCR和Nested PCR對室內(nèi)用不同接種量人工接種白粉菌后在不同潛育侵染階段取樣的小

4、麥葉片做病原菌的PCR測定分析.用最低接種量300個孢子/cm<'2>時,采用常規(guī)PCR能從接種3d后的小麥葉片中檢測到白粉菌DNA,而用Nested-PCR能從接種1d后的小麥葉片中檢測到潛伏侵染的白粉菌.在人工接種的條件下Nested PCR比常規(guī)PCR對檢測相同程度的潛伏侵染至少提前2-3d.在潛育侵染早期和接種濃度低時,Nested PCR 比常規(guī) PCR 在檢測效果上有明顯優(yōu)勢. 從北京和山東兩地的秋苗上,共選取11個

5、采樣點對人工接種小麥白粉菌或自然侵染的葉片取樣,用常規(guī) PCR 和 Nested-PCR 對未顯癥葉片的檢測結(jié)果表明,常規(guī)PCR測定的葉片侵染率對葉片離體培養(yǎng)測得的侵染率的直線回歸預(yù)測式只在0.05水平上顯著(r<'2>=0.49,P=0.0163),有6個樣點未測到侵染病葉.而Nested PCR測定的葉片侵染率與葉片離體培養(yǎng)測得的侵染率的直線回歸式極顯著(r<'2>=0.66,P=0.0023).此結(jié)果表明,Nested PCR方法