腺病毒介導(dǎo)鈣調(diào)磷酸酶Aα基因過表達(dá)在缺血再灌注和腎上腺素能受體誘導(dǎo)的心肌凋亡中的機制研究.pdf

1、第一部分鈣調(diào)磷酸酶在缺氧/復(fù)氧和腎上腺素能受體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用 目的研究鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin，CaN)在缺氧/復(fù)氧和腎上腺素能受體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用。 方法體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，觀察單純?nèi)毖?4h/復(fù)氧4h(H/R)及異丙腎上腺素(Iso10μmol/L)+缺氧24h/復(fù)氧4h(Iso+H/R)共同作用下心肌細(xì)胞凋亡率的變化，以及相應(yīng)的鈣調(diào)磷酸酶的表達(dá)。用DNALadder法及流式細(xì)胞儀D

2、NA含量測定法(PI標(biāo)記)檢測心肌細(xì)胞凋亡，RT-PCR法檢測CaNmRNA的水平。 結(jié)果Iso(10μmol/L)可以增加缺氧24h/復(fù)氧4h誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率(10.763±1.554vs8.737±1.120，P＜0.05)，同時CaNmRNA水平隨之增加(0.689±0.035vs0.464±0.023，P＜0.01)，CaN抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)可降低Iso+H/R所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率(6.270±0.306vs

3、10.763±1.554，P＜0.01)。 結(jié)論β-腎上腺素能受體激動劑可促進(jìn)H/R所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，并伴隨有CaN表達(dá)的增加；CaN抑制劑CsA可抑制二者共同作用所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，說明CaN參與了心肌細(xì)胞凋亡，有促細(xì)胞凋亡的作用。 第二部分大鼠鈣調(diào)磷酸酶Aα基因重組腺病毒載體的構(gòu)建 目的構(gòu)建大鼠鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin，CaN)Aα基因重組腺病毒載體(AdCnAα)。方法RT-PCR法擴增大鼠Cn

4、Aα基因(1.59kb)，克隆至T載體，酶切鑒定和DNA測序證實CnAα序列正確后，用內(nèi)切酶將CnAα亞克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)粒pShuttle2-IRES-EGFP，構(gòu)建載體pShuttle2-CnAα-IRES-EGFP，再通過酶切位點將CnAα-IRES-EGFP基因表達(dá)盒與pAdeno-x腺病毒載體骨架連接，構(gòu)建重組腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，出現(xiàn)CPE后收集含病毒的上清，抽提病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定。 結(jié)果測序證實Cn

5、Aα基因正確克隆到T載體中，酶切鑒定證實CnAα-IRES-EGFP基因表達(dá)盒成功重組到腺病毒載體基因組E1缺失區(qū)，并在HEK293細(xì)胞中成功包裝出具有感染活性的重組腺病毒顆粒。 結(jié)論本實驗成功構(gòu)建了以增強型綠色熒光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein，EGFP)為報告基因的大鼠CnAα基因的重組腺病毒載體，并在HEK293細(xì)胞中成功包裝出重組腺病毒顆粒。 第三部分鈣調(diào)磷酸酶Aα基因過表達(dá)

6、在缺氧/復(fù)氧和腎上腺素能受體介導(dǎo)的心肌凋亡中的作用 目的研究腺病毒介導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶Aα基因(AdCnAα)過表達(dá)對缺氧/復(fù)氧和腎上腺素能受體介導(dǎo)的心肌凋亡中的作用及p38MAPK的變化。 方法體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，分別給予Iso(10μmol/L)+缺氧24h/復(fù)氧4h(Iso+H/R)及感染重組腺病毒(AdCnAα)+Iso+H/R處理，觀察AdCnAα對Iso+H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。用DNALadder法及

7、流式細(xì)胞儀DNA含量測定法(PI標(biāo)記)檢測心肌細(xì)胞凋亡，用RT-PCR法和Western-blot法分別檢測CaNmRNA及蛋白表達(dá)。用Western-blot法檢測腺病毒介導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶Aα基因(AdCnAα)過表達(dá)后p-38、p-p38MAPK的變化。 結(jié)果心肌細(xì)胞感染CnAα重組腺病毒組(AdCnAα+Iso+H/R)的細(xì)胞凋亡率比未感染組(Iso+H/R)明顯增加(14.247±0.525vs10.763±1.554，P

8、＜0.01)，且均高于正常對照組；同時p-p38MAPK的表達(dá)也比正常對照組分別增加2.42±0.19倍和1.60±0.22倍(P＜0.01)；p38MAPK的表達(dá)在干預(yù)前后同正常對照組比較無差異性變化(P＞0.05)。 結(jié)論腺病毒介導(dǎo)的CnAα過表達(dá)可使Iso+H/R共同作用誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率增加，p38MAPK可能參與了CaN促進(jìn)Iso+H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 第四部分鈣調(diào)磷酸酶在離體大鼠缺血再灌注

9、及腎上腺素能受體介導(dǎo)心肌凋亡中的作用 目的研究鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin，CaN)在缺血再灌注及異丙腎上腺素致心肌凋亡時的作用。 方法采用Langendorff大鼠離體心臟灌流技術(shù)，制備不同時間缺血/再灌注(I/R)和/或不同劑量異丙基腎上腺素(Iso)所致心肌損傷模型，在此基礎(chǔ)上給予鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A(CsA)，觀察心肌細(xì)胞凋亡率的變化及鈣調(diào)磷酸酶(CaN)的表達(dá)，由原位末端標(biāo)記法(TUNEL)確定心肌細(xì)

10、胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化，RT-PCR法檢測CaNmRNA水平。 結(jié)果單純Iso在一定劑量時可致心肌細(xì)胞凋亡，并可增加I/R所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率，CaNmRNA水平隨之增加，CaN抑制劑環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)可降低I/R和Iso共同作用所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率。 結(jié)論異丙腎上腺素可促使I/R所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并且伴隨CaN表達(dá)的增加，CaN抑制劑CsA可降低I/R和Iso共同作用所

11、誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，說明CaN參與了心肌細(xì)胞凋亡，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。 第五部分β受體阻滯劑對鈣調(diào)磷酸酶及腺病毒介導(dǎo)鈣調(diào)磷酸酶Aα基因過表達(dá)的影響研究 目的研究不同選擇性的β-腎上腺素能受體阻滯劑對缺血/再灌注(I/R)或缺氧/復(fù)氧(H/R)及異丙腎上腺素(Iso)致心肌凋亡時心肌細(xì)胞凋亡率的影響及其對鈣調(diào)磷酸酶(CaN)的調(diào)節(jié)作用。 方法采用Langendorff大鼠離體心臟灌流技術(shù)制備I/R+Iso所致離體

12、心臟損傷模型；體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的方法制備腺病毒介導(dǎo)的CnAα(AdCnAα)過表達(dá)后，再H/R+Iso作用致心肌細(xì)胞損傷模型。在損傷模型基礎(chǔ)上給予不同選擇性的β-腎上腺素能受體阻滯劑(阿替洛爾、卡維地洛)進(jìn)行干預(yù)，觀察不同藥物對心肌細(xì)胞凋亡率及CaNmRNA表達(dá)的影響，用TUNEL或DNALadder法確定心肌細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法檢測CaNmRNA水平。 結(jié)果采用Langendorff大鼠離

13、體心臟灌流技術(shù)制備的I/R+Iso所致心肌損傷模型，經(jīng)卡維地洛干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡率和CaNmRNA水平與干預(yù)前比較均降低(P＜0.05)，二者變化趨勢呈正相關(guān)；經(jīng)阿替洛爾干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡率和CaNmRNA水平與干預(yù)前比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞法制備的感染CnAα重組腺病毒(AdCnAα)后H/R+Iso所致心肌細(xì)胞損傷模型，經(jīng)阿替洛爾和卡維地洛干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡率與干預(yù)前比較均降低，差異有顯著性意義(