變形鏈球菌pacA和gtfB-cat與ctxB嵌合表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其原核表達.pdf

1、齲病被認為是一種細菌感染性疾病，嚴(yán)重影響著人類健康，其中變形鏈球菌是最主要的致齲菌之一。多年來，學(xué)者們一直嘗試用免疫學(xué)的方法來預(yù)防齲病，期望通過主動免疫或被動免疫來阻止致齲菌對宿主口腔的粘附與定殖，從而減少齲齒的發(fā)生。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物來生產(chǎn)疫苗的研究日益深入，轉(zhuǎn)基因植物疫苗能夠通過直接口服的給藥方式誘導(dǎo)動物和人體的粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，具有安全、有效、廉價和方便等優(yōu)點，顯示出較為廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟效益。 本研究旨在構(gòu)建

2、含變形鏈球菌中富集T、B細胞表位的表面蛋白氨基端A區(qū)的編碼基因pacA、葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)的編碼基因gtfB-cat及粘膜免疫佐劑霍亂毒素B亞單位的編碼基因ctxB嵌合表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植物疫苗，并證實其在大腸桿菌中正確表達，為可食嵌合體防齲疫苗的研究打下基礎(chǔ)。 方法：實驗共分兩部分： 第一部分變形鏈球菌pacA和gtfB-cat與ctxB嵌合表達質(zhì)粒的構(gòu)建 1.以質(zhì)粒pcDNA3-pac、pET-gtfB、pBS

3、-ctxB為模板，設(shè)計合成引物，獲得目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB； 2.通過T-A克隆構(gòu)建中間載體T-pacA、T-cat、T-ctxB； 3.T-ctxB及原核克隆載體pET32-a(+)經(jīng)EcoRJ和-ghoⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET-ctxB；T-pacA及pET-ctxB經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET-pacA-ctxB；T-cat及pET-pacA-ctxB經(jīng)BamHI和

4、EcoRI雙酶切后連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB。 第二部分重組質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB的原核表達 將重組質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB轉(zhuǎn)入表達宿主菌EcoliBL21(DE3)，通過IPTG化學(xué)誘導(dǎo)的方法表達目的蛋白。 結(jié)果：構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB經(jīng)酶切、PCR鑒定及測序證實目的基因pacA、gtfB-cat和ctxB均正確插入到載體pET-32