VEGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮通透性增高的分子機(jī)制及其在腎綜合征出血熱發(fā)病中的作用.pdf

1、漢坦病毒（Hantavirus,HV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae），漢坦病毒屬中的某些病毒如漢灘（型）病毒（hantaanvirus,HTNV）、漢城（型）病毒（Seoulvirus,SEOV）、新諾柏（型）病毒（Sinnombrevirus,SNV）等，可以感染人類并引起腎綜合征出血熱（hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（hantaviruspulmonar

2、ysyndrome,HPS）。自1976年李鎬汪等從韓國(guó)鄰近三八線的HFRS疫區(qū)捕獲的黑線姬鼠肺組織中分離到漢坦病毒76-118株以來(lái)[1]，各國(guó)學(xué)者相繼分離到不同型別的漢坦病毒，其中漢灘病毒和漢城病毒是引起我國(guó)HFRS傳播流行的主要病毒型別。
　　雖然經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的防控努力，我國(guó)HFRS的發(fā)病率已明顯下降，但由于迄今對(duì)HFRS缺乏有效特異的臨床治療措施，在重點(diǎn)疫區(qū)特別是國(guó)內(nèi)姬鼠型疫區(qū)，該病重型和危重型的臨床救治仍存在許多困難，

3、病死率仍居高不下。自20世紀(jì)70年代漢坦病毒成功分離之后，各國(guó)學(xué)者對(duì)漢坦病毒及其相關(guān)疾病的基礎(chǔ)和臨床研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是迄今該病的發(fā)病機(jī)理并未完全闡明，臨床也無(wú)特異有效的治療藥物。因此，繼續(xù)不斷深入探討HFRS/HPS的發(fā)病機(jī)制，積極研發(fā)特異的抗病毒治療藥物，仍然是該病防治研究的難題和熱點(diǎn)。
　　已知導(dǎo)致HFRS血管滲漏的機(jī)制較多，血管內(nèi)皮調(diào)控通透功能的損傷或喪失在發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因

4、子（VEGF）的表達(dá)和分泌增多，可能是本病血管滲漏的重要病理機(jī)制。此外，內(nèi)皮細(xì)胞間的多種連接蛋白在調(diào)節(jié)血管通透性方面同樣起著重要的作用，后者與VEGF的關(guān)系也日益受到關(guān)注。
　　本研究首先觀察了腎綜合征出血熱（HFRS）患者各病期外周血VEGF、可溶性(游離)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（sVEGFR2）、血管生成素-1（ANG-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）水平的變化。然后應(yīng)用RNAi技術(shù)，分析了VEGF

5、對(duì)HTNV感染的體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性以及對(duì)細(xì)胞間重要連接蛋白Claudin-1和VE-cadherin表達(dá)的影響，在此基礎(chǔ)上分析探討了病毒與VEGF、Claudin-1和VE-cadherin之間的相互作用及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。
　　本研究的主要結(jié)果如下
　　1．HFRS患者外周血VEGF等細(xì)胞因子水平的變化情況
　　首先檢測(cè)了68例不同病期患者外周血上述5種細(xì)胞因子的表達(dá)情況，并以20例健康人作為對(duì)

6、照。其次，為了驗(yàn)證VEGF的檢測(cè)結(jié)果，又對(duì)20例HFRS患者病程5期連續(xù)動(dòng)態(tài)收集的外周血標(biāo)本中的VEGF進(jìn)行了測(cè)定。在所有觀察患者中，血漿VEGF水平從發(fā)熱期開始增高，休克期達(dá)到峰值，少尿期開始迅速下降，在多尿期和恢復(fù)期回落到正常水平。sVEGFR2、ANG-1水平在休克、少尿、多尿期均低于健康對(duì)照；TNF-α和IFN-γ水平在發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期和多尿期均高于健康對(duì)照組，其中大多數(shù)與后者比較有明顯差異。此外，對(duì)20例各病期連續(xù)

7、動(dòng)態(tài)采集的血樣進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)表明，VEGF在休克期表達(dá)確實(shí)明顯升高，與其它各期（212.5～397.5pg/mL）比較均有顯著性差異。
　　2．VEGF等細(xì)胞因子對(duì)HTNV感染的體外培養(yǎng)細(xì)胞的作用以及通透性的檢測(cè)
　　2.1VEGFR2siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)系的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)利用siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSilencer4.1-CMVneo在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA。shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞機(jī)制切割成siRNA

8、，然后siRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物上（RISC），該復(fù)合物能夠結(jié)合到目的mRNA。為避免瞬時(shí)轉(zhuǎn)染造成的維持時(shí)間短、轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)即構(gòu)建了一個(gè)可在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)錄出shRNA的表達(dá)載體pSilencer-VEGFR2，它包含有一個(gè)G418抗性基因，在選擇性壓力的培養(yǎng)下，可在HUVEC細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)出VEGFR2shRNA。
　　2.2TRANSWELL法檢測(cè)不同因子作用后內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化

9、
　　以前述體外培養(yǎng)的HUVEC和采用siRNA技術(shù)建立的VEGFR2基因敲除血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECVEGFR2(-)）為研究對(duì)象，觀察HTNV感染或/和各種細(xì)胞因子作用后內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化。結(jié)果顯示：HTNV單獨(dú)感染并不能直接增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，但是加入VEGF后即可明顯增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。在各種影響內(nèi)皮細(xì)胞通透性的因素中，VEGF+HTNV的作用最強(qiáng)，其次為單用VEGF、TNF-α或IFN-γ。對(duì)于HUVECVEGFR

10、2(-)細(xì)胞的結(jié)果顯示，應(yīng)用VEGF刺激HTNV感染前后的兩種細(xì)胞對(duì)HUVEC通透性的影響大于VEGFR2(-)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，通透抑制因子Ang-1不僅可以抑制VEGF增強(qiáng)血管內(nèi)皮通透性這一效應(yīng)，也可以減弱或抑制HTNV感染后內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF作用的增強(qiáng)效應(yīng)，可以減低HTNV感染后內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的敏感性。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HTNV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞可以增加細(xì)胞對(duì)VEGF的敏感程度；應(yīng)用基因敲除VEGFR2的細(xì)胞試驗(yàn)

11、進(jìn)一步證明，在調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高方面，減低或抑制VEGFR2的表達(dá)具有和Ang-1類似的作用，均可抑制HTNV感染致血管內(nèi)皮通透性增高的作用。
　　3VEGF介導(dǎo)的細(xì)胞間連接蛋白的變化與血管通透性的關(guān)系
　　VEGF通過(guò)跨細(xì)胞途徑（transcellularpathway/route）不僅可以直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，而且可以直接或間接的影響細(xì)胞間緊密連接蛋白Claduin-1和黏附連接蛋白VE-cadh

12、erin的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞旁途徑（paracellularpathway/route）來(lái)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性。
　　4單層細(xì)胞跨膜電阻值(TEER)的測(cè)定
　　通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的跨膜電阻（trans-endothelialelectricalresistance,TEER）可以直接反映內(nèi)皮的通透性。單層培養(yǎng)感染HTNV和未感染的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在第7日時(shí)TEER分別穩(wěn)定在13?·cm2和10?·cm2，然后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)V

13、EGF刺激HTNV感染和未感染的細(xì)胞，在加入VEGF3h時(shí)，TEER下降幅度較大，之后逐漸趨緩。證明跨膜電阻下降，細(xì)胞間連接被破壞，在VEGF刺激3h時(shí)達(dá)到峰值。
　　在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用real-timePCR和westernbolt分別檢測(cè)VEGF、Clandin-1、VE-cadherinmRNA水平以及蛋白水平的表達(dá)。并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，驗(yàn)證VEGF刺激HTNV感染的內(nèi)皮細(xì)胞上述兩種蛋白的表達(dá)。最后，通過(guò)間接免疫熒光觀

14、察細(xì)胞膜上兩種蛋白的表達(dá)。
　　Real-timePCR結(jié)果顯示：HTNV感染內(nèi)皮細(xì)胞后可上調(diào)VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄，輕微下調(diào)Clauin-1和VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄。用VEGF刺激HTNV感染的內(nèi)皮細(xì)胞，Claudin-1和VE-caherin的轉(zhuǎn)錄均明顯下調(diào)。Westernblot分析表明，HTNV感染內(nèi)皮細(xì)胞后VEGF的表達(dá)未觀察到明顯變化，Claudin-1和VE-cadherin的表達(dá)與real-timePCR結(jié)果

15、一致。應(yīng)用流式細(xì)胞儀與間接免疫熒光法檢測(cè)VEGF刺激HTNV感染的HUVEC上述兩種蛋白的表達(dá)，結(jié)果與PCR和westernblot的研究結(jié)果一致。
　　結(jié)論：HFRS患者血管通透性增高可能與休克期VEGF高表達(dá)有關(guān)，sVEGFR2、ANG-1、TNF-α、INF-γ表達(dá)量的變化可能在VEGF介導(dǎo)的血管通透性增高中發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用。體外試驗(yàn)證明HTNV感染可增加VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的敏感性，這一效應(yīng)可被生理濃度的ANG-1