兔椎間盤(pán)退變模型構(gòu)建及磁性標(biāo)記ADSC椎間盤(pán)內(nèi)移植的影像學(xué)和病理學(xué)初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 由椎間盤(pán)退變(Intervertebral disc degeneration，IDD)引起的下腰痛是人類(lèi)面臨的重大健康問(wèn)題之一，下腰痛給患者和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，目前臨床還沒(méi)有有效的治療手段。干細(xì)胞移植治療IDD有著廣闊的應(yīng)用前景，將會(huì)為臨床治療IDD所引起的下腰痛提供一種新的治療手段，給IDD所引起下腰痛的病人帶來(lái)福音。MRI(Magnetic resonance iamging)具有良好的空間分辨率和時(shí)

2、間分辨率，能同時(shí)獲得解剖及生理信息，可對(duì)移植的磁性標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、重復(fù)的活體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
　　 研究目的:
　　 1.探討X線透視引導(dǎo)兔椎間盤(pán)穿刺誘導(dǎo)兔椎間盤(pán)退變的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及其病理學(xué)改變，以及椎間盤(pán)穿刺法構(gòu)建兔IDD模型的可行性和可靠性。
　　 2.探討Gd-DTPA、SPIO標(biāo)記ADSC椎間盤(pán)內(nèi)移植對(duì)退變椎間盤(pán)的修復(fù)作用。
　　 3.MRI活體監(jiān)測(cè)Gd-ADSC、SPIO-ADSC在退變

3、椎間盤(pán)內(nèi)存活、遷移和轉(zhuǎn)歸，為臨床干細(xì)胞移植治療IDD提供理論基礎(chǔ)和活體示蹤、監(jiān)測(cè)方法。
　　 材料與方法:
　　 1.兔腰椎IDD模型的制作：
　　 18G穿刺針透視引導(dǎo)下穿刺兔腰椎椎間盤(pán)，制作IDD模型，模型制作前、制作后3天(0.5周)、1周、2周、3周、4周、5周、8周、10周行MRI掃描，觀察穿刺后椎間盤(pán)的退變過(guò)程，并在各時(shí)間點(diǎn)取病理行組織學(xué)檢查。
　　 2.兔ADSC的原代培養(yǎng)與鑒定：
　

4、　 采用貼壁法對(duì)兔ADSC進(jìn)行分離、培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行CD44、CD90、CD34、CD45等表面抗原鑒定。
　　 3.兔ADSC的體外標(biāo)記及檢測(cè)：
　　 用BrdU、Gd及SPIO對(duì)ADSC進(jìn)行標(biāo)記，用免疫熒光、MRI掃描、普魯士藍(lán)染色檢測(cè)標(biāo)記的可行性，標(biāo)記后行臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的存活率。
　　 4.兔ADSC的移植及MRI活體示蹤：
　　 取IDD模型制作后2周的兔子，手術(shù)暴露L2/3、

5、L3/4、L4/5椎間盤(pán)，用微量注射器分別注射25μLPBS、重懸于25μLPBS的BrdU-ADSC(含106個(gè)細(xì)胞)及重懸于25μLPBS的BrdU+Gd-ADSC或BrdU+SPIO-ADSC(含106個(gè)細(xì)胞)。ADSC移植前、移植后即刻、3天、1周、2周、3周、4周、6周、8周(分別對(duì)應(yīng)于模型制作后2周、2.1周、2.5周、3周、4周、5周、6周、8周、10周)進(jìn)行X光照片及MRI掃描。
　　 5.病理學(xué)檢查：在MRI掃

6、描各時(shí)間點(diǎn)取組織行病理學(xué)檢查。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.ADSC體外標(biāo)記及檢測(cè)：
　　 ADSCBrdU標(biāo)記后，免疫熒光染色細(xì)胞核可見(jiàn)綠色熒光；SPIO標(biāo)記后，普魯士藍(lán)染色細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多藍(lán)染的鐵顆粒，標(biāo)記的細(xì)胞T2WI信號(hào)強(qiáng)度及T2值明顯減低；Gd標(biāo)記后，細(xì)胞T1WI上信號(hào)明顯增高，T1值減低。標(biāo)記細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞臺(tái)

7、盼藍(lán)拒染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.IDD模型：
　　 透視引導(dǎo)下，穿刺針可準(zhǔn)確無(wú)誤穿刺至椎間盤(pán)中心。隨著時(shí)間的推移，18G針穿刺的椎間盤(pán)逐漸退變，T2WI信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低，穿刺后2周椎間盤(pán)退變迅速，2周后已基本穩(wěn)定，退變緩慢。退變椎間盤(pán)T2WI信號(hào)強(qiáng)度兩兩比較結(jié)果顯示，2周椎間盤(pán)T2WI信號(hào)強(qiáng)度與1周比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與3周比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.ADSC移植后MRI活體示蹤：
　　 Gd-A

8、DSC移植后即刻T1WI-SPIR序列上可見(jiàn)椎間盤(pán)內(nèi)高信號(hào)，但隨著時(shí)間的推移，高信號(hào)迅速減低。SPIO-ADSC移植后即刻T2WI-FFE序列上可見(jiàn)椎間盤(pán)內(nèi)明顯低信號(hào)，常規(guī)T2WI及T2WI-SPIR序列上亦可顯示椎間盤(pán)內(nèi)低信號(hào)，移植標(biāo)記細(xì)胞的椎間盤(pán)T2值較未移植細(xì)胞及移植未標(biāo)記細(xì)胞的椎間盤(pán)明顯減低，SPIO-ADSC移植至椎間盤(pán)后10周，仍可檢測(cè)到明顯的T2WI-FFE低信號(hào)存在。
　　 4.ADSC移植后MRI評(píng)價(jià)：

9、　　 椎間盤(pán)穿刺后0～2周，椎間盤(pán)T2WI信號(hào)強(qiáng)度迅速減低，模型制作后2周，行移植細(xì)胞，SPIO-ADSC組椎間盤(pán)自移植后至移植后第8周(即模型制作后10周)，其T2WI信號(hào)強(qiáng)度與ADSC組及Gd-ADSC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞移植后第1周及第2周(即模型制作后第3周及第4周)，ADSC組及Gd-ADSC組T2WI信號(hào)強(qiáng)度與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 椎間盤(pán)穿刺后0～2周，椎間盤(pán)T2弛豫時(shí)間迅速減低，SPIO

10、-ADSC組椎間盤(pán)自移植后至移植后第8周(即模型制作后10周)，其T2弛豫時(shí)間與ADSC組及Gd-ADSC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞移植后第3天(即模型制作后第2.5周)，ADSC組及Gd-ADSC組T2弛豫時(shí)間與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 Gd-ADSC移植至椎間盤(pán)后，能通過(guò)T1值測(cè)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，移植細(xì)胞后MRI掃描，Gd-ADSC組T1值明顯減低，Gd-ADSC組椎間盤(pán)自移植后至移植后第1周(即模型制作后3周)，

11、其T1弛豫時(shí)間與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.病理學(xué)檢查：
　　 正常椎間盤(pán)纖維環(huán)、髓核分界清晰，髓核細(xì)胞胞漿淡染，纖維環(huán)呈同心圓層狀排列，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)基本一致，軟骨終板連續(xù)。
　　 IDD模型制作后，椎間盤(pán)髓核細(xì)胞壞死、崩解，失去正常形態(tài)，纖維環(huán)排列不規(guī)整，出現(xiàn)裂隙及斷裂，纖維環(huán)粘液變性，膠原纖維腫脹、壞死，軟骨終板變薄、凹陷、破裂，后期椎間盤(pán)明顯纖維化，軟骨終板多處破裂。
　　 PB

12、S組椎間盤(pán)髓核細(xì)胞壞死，失去正常形態(tài)，纖維環(huán)排列不規(guī)整，發(fā)生粘液變性，膠原纖維腫脹，出現(xiàn)裂隙及斷裂，注射PBS后8周后椎間盤(pán)明顯纖維化，結(jié)構(gòu)紊亂，椎間盤(pán)高度明顯減低。
　　 ADSC移植組椎間盤(pán)與同時(shí)間點(diǎn)PBS組比較，退變程度較輕，髓核及纖維環(huán)內(nèi)均可見(jiàn)胞漿豐富的軟骨樣細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.X線透視引導(dǎo)下18G穿刺針穿刺椎間盤(pán)可成功制作逐漸退變、重復(fù)性好的兔IDD模型。
　　 2.利用BrdU、G