核酸適體在蛋白質(zhì)和小分子檢測(cè)中的新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)如免疫球蛋白E及小分子如腺苷等生物分子在維系生物個(gè)體的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。對(duì)這些生命物質(zhì)進(jìn)行快速而有效的監(jiān)測(cè)對(duì)保持生個(gè)體正常的機(jī)能有著直接而現(xiàn)實(shí)的意義。生物傳感器在眾多分析方法中獨(dú)樹一幟,他不僅具有常規(guī)分析方法的優(yōu)點(diǎn),而且能模擬生命活動(dòng)過程,能提供原位、實(shí)時(shí)分析。核酸適體是一段自核酸文庫(kù)中隨機(jī)篩選出的功能化單鏈短DNA或RNA序列,具有化學(xué)穩(wěn)定,尺寸小,價(jià)格低廉,高親和力,高特異性以及靶物質(zhì)廣泛等的特點(diǎn),這使它在構(gòu)建一系

2、列目標(biāo)分子檢測(cè)體系中成為人們的首選。本文以核酸適體為目標(biāo)識(shí)別探針,主要在以下幾個(gè)方面開展工作:
　　 (1)基于G四股螺旋和信號(hào)增強(qiáng)的熒光寡核苷酸探針用于蛋白質(zhì)的超靈敏檢測(cè)[第2章]。本章中,我們報(bào)道了一種標(biāo)記芘的富G核酸探針及其在IgE檢測(cè)中的應(yīng)用,為探究人類端粒的生物學(xué)功能提供了有益的參考。基于分子間G四股螺旋結(jié)構(gòu),結(jié)合S1核酸酶和目標(biāo)識(shí)別核酸適體,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種末端單芘標(biāo)記的寡核酸探針并提出一種新的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。該方法不

3、僅有效回避了報(bào)告基團(tuán)特異性位點(diǎn)優(yōu)化和芘單體熒光易被核酸堿基猝滅的問題,同時(shí)還提出了一種信號(hào)增強(qiáng)的響應(yīng)機(jī)理,成功用于均相中IgE超靈敏檢測(cè)。該傳感器的線性范圍為4.72×10-12～7.56×10-9M,回歸系數(shù)為0.9941,檢測(cè)下限9.45×10-14M。
　　 (2)基于背景消除和信號(hào)增強(qiáng)的電化學(xué)核酸適體傳感器用于小分子超靈敏檢測(cè)[第3章]。本章中,我們以腺苷為目標(biāo)模型提出了一種多功能的電化學(xué)核酸適體傳感機(jī)理用于小分子的超靈

4、敏檢測(cè)。巰基修飾的核酸適體探針上標(biāo)記二茂鐵電活性分子,并將其固定在電極表面,在核酸適體序列的兩端引入大腸桿菌核酸內(nèi)切酶Ⅰ的酶切位點(diǎn),這不僅能夠扣除背景電流,同時(shí)形成一種信號(hào)增強(qiáng)的響應(yīng)機(jī)理。沒有目標(biāo)物腺苷存在時(shí),核酸適體折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu),在莖部形成一個(gè)酶切雙鏈區(qū),酶切后二茂鐵脫離電極表面,沒有二茂鐵的響應(yīng)電流信號(hào)產(chǎn)生。有腺苷存在時(shí),腺苷和核酸適體結(jié)合誘導(dǎo)核酸適體發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變,酶切雙鏈區(qū)域消失,核酸內(nèi)切酶就無法切斷適體探針序列。此時(shí)二茂鐵分子

5、仍離電極表面很近,故能夠觀察到二茂鐵的響應(yīng)電流峰。這種傳感檢測(cè)體系,在腺苷濃度極低的情況下仍能檢測(cè)到電流信號(hào)。檢測(cè)下限達(dá)到10-13M,線性響應(yīng)范圍為3.74×10-12～3.74×10-8M。我們提出的這種新型電化學(xué)傳感檢測(cè)方法極大的拓展了各種基于核酸適體傳感體系用于目標(biāo)檢測(cè)的分析范圍。
　　 (3)基于分子信標(biāo)核酸適體熒光生物探針用于腺苷的高選擇性檢測(cè)[第4章]。本章中,基于核酸適體結(jié)合目標(biāo)誘導(dǎo)構(gòu)型轉(zhuǎn)換和DNA雜交原理,以腺