新型三維多肽神經(jīng)組織工程支架材料制備及體外誘導神經(jīng)干細胞的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：探討新生S-D鼠大腦皮層組織神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)以及鑒定的方法。
　　 方法：分離新生S-D鼠(出生1-3d 內(nèi))的大腦皮層組織，機械吹打后，無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細胞，獲得具有自我增殖能力的細胞克隆，并將細胞克隆貼壁培養(yǎng)測其分化能力。應用抗Nestin、NSE、GFAP 免疫組織化學方法鑒定細胞克隆。
　　 結(jié)果：從新生S-D鼠大腦皮層組織分離的細胞懸液，經(jīng)懸浮培養(yǎng)，生成大量具有增殖能力的細

2、胞，可形成神經(jīng)球，抗Nestin。細胞克隆貼壁培養(yǎng)后神經(jīng)球分化為神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞，抗NSE陽性，抗GFAP陽性。
　　 結(jié)論：上述方法分離的細胞具有自我更新、自我復制及分化為神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞的能力，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞。
　　 第二部分
　　 目的：設計合成含IKVAV的兩親性肽，在不同的條件下，探討其自組裝為三維多孔凝膠結(jié)構(gòu)及其力學特性。
　　 方法：用固相法合成肽，MS測其分子量，HPLC測其純

3、度；肽溶于0.1M NaOH溶液中，配10，2，1，0.5wt[％]肽溶液，各取200ul相應肽溶液，分別加入等體積的DMEM/F12培養(yǎng)液，或置于10M濃鹽酸蒸汽中，或涂布于蓋玻片上，置于37℃干燥箱。TEM及SEM檢測自組裝形成的凝膠，用血流計測定凝膠的流變學特性。
　　 結(jié)果：MS示肽的分子量為1438.31，HPLC示其純度為96[％]。肽溶液在DMEM/F12觸發(fā)下，數(shù)秒鐘內(nèi)形成凝膠；于10M HCL蒸氣中，2小時后完

4、全形成薄層凝膠；37℃的干燥箱中，未見凝膠形成；SEM示10wt[％]肽形成的凝膠由納米纖維構(gòu)成，呈板層狀排列，為多孔厚壁的結(jié)構(gòu)。透射電鏡顯示：2，1，0.5wt[％]肽自組裝凝膠由編織狀納米纖維構(gòu)成。1wt[％]肽的凝膠纖維直徑有3～5納米，長度100納米～1500納米；2wt[％]肽的凝膠納米纖維排列緊密；0.5wt[％]肽的凝膠的納米纖維較細，纖維間空隙較大；時間頻率流變學表明：損耗模量呈線性并且比存儲模量要小，表明自組裝凝膠有一

5、定強度，有足夠的強度可支撐細胞接種。
　　 結(jié)論：本實驗合成兩親性肽，在DMEM/F12溶液中可自組裝成多孔凝膠，成功構(gòu)建了“聰明的”含活性配體神經(jīng)組織工程支架材料。
　　 第三部分
　　 目的：體外培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，接種于多肽自組裝二維多孔凝膠表面，觀察二維凝膠表面其對細胞生長及分化影響。
　　 方法：取乳小鼠大腦皮質(zhì)，機械分離，無血清培養(yǎng)基懸浮法培養(yǎng)出神經(jīng)細胞，免疫組織化學SABC鑒定。肽溶于NaOH

6、溶液中，PH=9.0，濃度為1wt[％]，加DMEM/F12在蓋玻片上觸發(fā)多肽自組裝為凝膠，透射電鏡檢測。實驗組：神經(jīng)細胞接種于二維凝膠表面；對照組：神經(jīng)細胞接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片表面；倒置相差顯微鏡觀察細胞生長及分化情況，免疫細胞化學染色，激光共聚焦顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果：免疫組化鑒定：培養(yǎng)的細胞為NSCs，Nestin(＋)。透射電鏡示：自組裝凝膠為交織成網(wǎng)狀的納米纖維。實驗組：7天后，倒置相差顯微鏡觀察到神經(jīng)細胞長

7、出突起，對照組僅有未分化神經(jīng)干細胞球。激光共聚焦顯微鏡觀察：在實驗組，NSCs分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞，NF(+)，示強紅色熒光，GFAP(+)，示弱綠色熒光；對照組：僅有神經(jīng)干細胞球，Nestin(＋)，示綠色熒光。
　　 結(jié)論：本實驗首次采用不需胰蛋白酶或EDTA，培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞。透射電鏡證實凝膠為多孔的納米纖維。免疫細胞化學鑒定：二維多孔凝膠對NSCs有良好的細胞相容性，其表面可誘導NSCs分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞。證明

8、二維自組裝凝膠可作為優(yōu)良的神經(jīng)組織工程支架材料。
　　 第四部分
　　 目的：合成兩親性肽，在含神經(jīng)干細胞(NSCs)的DMEM/F12觸發(fā)下自組裝成三維多孔的凝膠，研究其對細胞生長及分化的影響。
　　 方法：固相法合成肽。取乳鼠大腦皮質(zhì)，機械分離，無血清培養(yǎng)，免疫組織化學鑒定。實驗組(EG)：分A1及A2亞組，1wt[％] 肽加入含細胞的等體積的DMEM/F12液中；對照組(CG)：分B1及B2亞組，細胞接種于

9、多聚賴氨酸包被的蓋玻片表面，免疫細胞化學染色，LCM及IPCM觀察，TEM檢測細胞在凝膠中的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：MS示肽的分子量為1438.31，HPLC示其純度為96[％]。TEM顯示，凝膠為交織排列的納米纖維。免疫組化鑒定：培養(yǎng)的細胞為NSCs，Nestin(＋)。IPCM觀察：EG中，NSCs在凝膠內(nèi)部，2天形成細胞球，7天形成神經(jīng)元樣形態(tài)；CG中，B1亞組僅形成細胞球，B2亞組細胞可形成神經(jīng)元形態(tài)。LCM觀察，EG中