比較兔不同動脈間TES基因的表達及其與動脈粥樣的關系及可能的機制.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多發(fā)性疾病，是目前人類致死和致殘的主要原因。AS的病理改變以動脈內脂質沉積，粥樣斑塊形成及伴隨的炎癥反應為特征，造成血管部分或完全堵塞進而導致心、腦、腎等多器官缺血、梗死，給人類健康造成極大的危害。大量研究已經表明不同動脈間發(fā)生動脈粥樣硬化的程度存在差別，其中冠狀動脈較易發(fā)生粥樣硬化，而內乳動脈（internal mammary artery，IMA）粥樣硬化發(fā)生率

2、較低。正是這種差別的存在，使得內乳動脈成為了冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）左前降支首選的替代血管。目前已有研究表明：在冠脈搭橋手術后20年，IMA通暢率仍可大于90％。故此，內乳動脈的這種血管特性已成為當前研究的熱點。然而，目前這種血管特性的機制還沒有完全闡明。
　　睪丸相關轉錄因子（testis derived transcript，TES）基因是近年來新發(fā)現的基因

3、，其定位于人體染色體7q31.2上，編碼一個含421個氨基酸的蛋白質（testin）。testin是一種細胞骨架蛋白，主要分布于黏著斑和細胞間連接的區(qū)域，可以與一系列細胞骨架蛋白結合。目前研究普遍認為TES基因是一種抑癌基因。2012年Archacki等人首次研究了TES基因與動脈粥樣硬化的關系，他們發(fā)現TES基因在IMA的表達高于冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD），并且冠心病患者LAD的TES

4、基因表達低于非冠心病者。然而，TES基因在AS發(fā)生發(fā)展過程中起到何種作用及其相應的分子生物學機制目前尚不明確。
　　通過比較內乳動脈與冠狀動脈形態(tài)學及分子學的差異從而尋找影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵因素可能成為揭示動脈粥樣硬化發(fā)生機制的非常重要的思路和方法，從而為防止動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展提供新的手段。
　　目的：
　　本課題旨在通過比較TES基因在正常兔內乳動脈和冠狀動脈間的表達，以及其在高脂喂養(yǎng)3個月后兔內乳

5、動脈和冠狀動脈間的表達，明確TES基因在內乳動脈與冠狀動脈間的血管差異及對高脂的應答差異中的作用。同時進行原代內皮細胞培養(yǎng)，明確兩種來源內皮細胞表達TES的情況。通過在人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）過表達TES基因和下調TES基因，觀察TES基因對內皮細胞功能的影響，闡明TES基因與動脈粥樣硬化的關系及其可能的機制，為動脈粥樣硬化的研究提供新的思路和靶點。<

6、br>　　方法：
　　1.應用H-E染色法觀察正常家兔內乳動脈和冠狀動脈管壁形態(tài)，分別用RT-PCR、Real-Time PCR、Western blotting和免疫組化等方法從mRNA、蛋白及組織三個水平檢測TES基因在內乳動脈和冠狀動脈中的表達情況。同時，用酶消化法分離正常家兔內乳動脈和冠狀動脈的內皮細胞進行原代細胞培養(yǎng)，采用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blotting等方法比較這兩種來源不同的

7、內皮細胞TES基因表達的差別。
　　2.通過高脂飼養(yǎng)兔12周建立動脈粥樣硬化模型，用H-E染色法觀察內乳動脈和冠狀動脈管壁形態(tài)，分析評估兩種血管動脈粥樣硬化的發(fā)生情況，同時采用RT-PCR、Real-Time PCR和Western blotting等方法從mRNA及蛋白等水平比較高脂喂養(yǎng)前后內乳動脈與冠狀動脈中TES的表達差異。
　　3.選取HUVECs，通過構建過表達TES的質粒和shRNA干擾下調TES的質粒，利用慢病

8、毒轉染技術構建TES基因過表達和下調表達的HUVECs，研究TES基因對內皮細胞的生長、增殖、黏附、遷移和調亡等生物學行為的影響以及對動脈硬化相關基因的影響，探討TES影響細胞功能可能的分子生物學機制。
　　結果:
　　1.正常家兔內乳動脈與冠狀動脈解剖血管走行顯示，內乳動脈主干為橫向走行，沿途分叉較少；而冠脈走行于心臟的表面，其分支較多，遠端走行于心肌內，與心肌結合較為緊密。組織H-E結果顯示：二者血管壁結構大體可分為三層

9、，分別為內膜層、中膜層和外膜層。在結構上比較，內乳動脈中膜層含較多彈力纖維，冠脈則以平滑肌細胞為主，余結構二者無明顯差異。免疫組化結果表明：TES基因主要表達在兔內乳動脈和冠狀動脈的內皮層。RT-PCR、Real-Time PCR和Western blotting結果顯示：正常家兔內乳動脈TES基因的表達量高于冠脈的表達量（P<0.05）。TES基因在兔內乳來源的內皮細胞及冠脈來源的內皮細胞中均有表達，且內乳來源的內皮細胞的表達量高于冠

10、脈來源的內皮細胞（P<0.05）。
　　2.高脂喂養(yǎng)3月后，與正常組家兔相比，高脂組家兔血脂明顯升高，體重明顯增加，且冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化的比率高于內乳動脈（P<0.05）；高脂喂養(yǎng)3月后，家兔內乳動脈組織TES基因的表達量高于冠狀動脈組織（P<0.05）。與正常組相比，高脂喂養(yǎng)組內乳動脈組織的TES表達量升高，冠狀動脈組織TES的表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3.成功構建過表達TES基因重組質粒30

11、5-TES和TES shRNA下調質粒shRNA-TES1/TES2并用慢病毒感染人臍靜脈內皮細胞，成功建立TES過表達及TES下調的HUVECs。
　?。?）選取過表達TES的HUVECs和對照組細胞，進行細胞生長曲線的描繪和MTT增殖實驗，結果顯示：過表達TES的HUVECs，其生長速度和增殖較對照組沒有明顯變化（P>0.05）。細胞粘附實驗結果顯示，與對照組相比，過表達TES基因致HUVECs胞黏附能力下降；應用人急性單核細

12、胞白血病細胞（THP-1）與過表達TES的HUVECs進行共粘附實驗，結果顯示，其與單核細胞的共黏附能力亦下降；與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。劃痕愈合實驗結果顯示，305-empty組細胞遷移較對照組增強（P<0.05）。應用Hoechst33258染色液對過表達TES基因的HUVECs的凋亡能力進行分析，結果表明過表達TES基因不影響細胞凋亡。應用實時定量PCR對過表達TES基因的HUVEC與對照組細胞的血小板-內皮

13、細胞粘附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，CD31）、單核細胞趨化因子（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、P-選擇素（P-selectin）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metallopepti

14、dase-2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin，

15、TM）、組織因子途徑抑制因子（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）、一氧化氮合酶-3（nitric oxide synthase-3，NOS-3）以及凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1，LOX-1）的mRNA水平進行了檢測。結果顯示，PECAM-1、MMP-9、IL-6、TNF-α、NF-

16、Κb、TM、vWF、TFPI、NOS3、LOX-1較對照組細胞表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；MCP-1、MMP-2較對照組細胞表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；ICAM、P-selectin較對照組細胞表達水平無差異（P>0.05）。
　?。?）選擇下調TES的HUVECs和對照組細胞，進行細胞生長曲線的描繪和MTT增殖實驗，結果顯示：下調TES表達的人臍靜脈內皮細胞，其生長速度和增殖較對照組沒有明

17、顯變化（P>0.05）。細胞粘附實驗結果顯示，與對照組相比，下調TES基因表達致HUVECs黏附能力增加；應用單核THP-1細胞與下調TES的HUVECs進行共粘附實驗，結果顯示，其與單核細胞的共黏附能力亦增加；差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。劃痕愈合實驗結果顯示，shRNA-control組與shRNA-TES1、shRNA-TES2組在0h時，劃痕距離大體相同。shRNA-TES組細胞遷移較對照組下降（P<0.05）。應用Hoec

18、hst33258染色液對下調TES基因的HUVECs的凋亡能力進行分析，結果表明下調TES基因表達不影響內皮細胞凋亡。同樣，對下調TES基因的HUVECs與對照組細胞進行了動脈粥樣硬化相關基因mRNA水平的檢測。結果顯示，PECAM-1、MMP-9、IL-6、TNF-α、NF-Κb、TM、vWF、TFPI、NOS3、LOX-1較對照組細胞表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；MCP-1、MMP-2較對照組細胞表達水平升高，差異