他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的動(dòng)脈瘤與動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其機(jī)制.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景：
　　 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，近年來，動(dòng)脈疾病的發(fā)病率、致殘率、致死率明顯上升。動(dòng)脈疾病已經(jīng)成為危險(xiǎn)人類健康的定時(shí)炸彈，其中動(dòng)脈瘤和動(dòng)脈粥樣硬化均是慢性炎癥性動(dòng)脈疾病，隨著超聲、CTA、MRA的普及，動(dòng)脈瘤與動(dòng)脈粥樣硬化得以及時(shí)發(fā)現(xiàn)。大的動(dòng)脈瘤可以行開放性外科手術(shù)和微創(chuàng)腔內(nèi)隔絕術(shù)，小的動(dòng)脈瘤患者只能消極等待與檢查，目前尚無任何有效的藥物可逆轉(zhuǎn)或者是預(yù)防動(dòng)脈瘤的發(fā)生與發(fā)展。雖然動(dòng)脈粥樣硬化從基礎(chǔ)理論到臨

2、床特征，已經(jīng)被研究多年，但是目前動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病速度大于治療速度，它仍然是危險(xiǎn)人類健康的主力軍。因此，繼續(xù)尋找有效藥物，預(yù)防、逆轉(zhuǎn)與治療動(dòng)脈瘤與動(dòng)脈粥樣硬化，已經(jīng)是醫(yī)學(xué)研究者迫在眉睫的工作。
　　 眾所周知，口服3-羥-3-甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(他汀)對(duì)冠心病的病人是一種非常有效的治療方法。隨著他汀的治療，心血管病的發(fā)病率與死亡率下降歸功于血漿膽固醇濃度的降低和其他非脂機(jī)制，例如內(nèi)皮功能改善和抗炎效果。羅蘇伐他汀和阿托伐

3、他汀是兩種最廣泛的他汀，用以大大地降低血漿總膽固醇濃度和低密度脂蛋白膽固醇濃度。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，他汀能通過抑制NF-κB信號(hào)，激活可誘導(dǎo)的NO合酶的表達(dá)來減輕炎癥趨化因子的表達(dá)，減少M(fèi)MP-9容量，增加膠原和纖維帽的厚度。
　　 基于他汀類藥物的多效性，尤其是抗炎的作用，他汀類藥物有望在抗動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上成為一種抑制、逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈瘤有效的藥物。他汀是否能阻止人類腹主動(dòng)脈瘤的擴(kuò)張和破裂尚有爭(zhēng)議。有研究提示：在彈性酶誘導(dǎo)的大鼠

4、腹主動(dòng)脈瘤模型上，阿托伐他汀通過抑制巨噬細(xì)胞的聚集來抑制腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展，但是還尚沒有瑞蘇伐他汀抑制腹主動(dòng)脈瘤的確切療效報(bào)導(dǎo)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 研究他汀類藥物(瑞蘇伐他汀和阿托伐他汀)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的apoE基因敲除雄性小鼠的腹主動(dòng)脈瘤與主動(dòng)脈粥樣硬化的影響，并對(duì)其相關(guān)的作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 我們選用了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)apoE基因敲除雄性小鼠而獲得的腹主動(dòng)脈瘤與主動(dòng)脈粥樣

5、硬化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。60只apoE基因敲除雄性小鼠，隨機(jī)分成三組，每組20只。安慰劑組：給予不合藥物的飲用水；瑞舒伐他汀組：給予含瑞舒伐他汀10mg/kg/d的飲用水；阿托伐他汀組：給予含阿托伐他汀20mg/kg/d的飲用水。1周后，60只apoE基因敲除雄性小鼠均皮下植入含有血管緊張素Ⅱ1000ng/kg/min的ALZET(R)滲透泵誘導(dǎo)4周而成。我們每周測(cè)量小鼠體重。應(yīng)用Kent無創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)小鼠血壓變化。應(yīng)用小動(dòng)物活體超聲

6、成像系統(tǒng)探測(cè)腎上主動(dòng)脈的最大內(nèi)直徑和最大橫斷面積，以監(jiān)測(cè)不同組別小鼠的腎上主動(dòng)脈內(nèi)直徑和橫斷面積大小的變化；按照Daugherty分型法，根據(jù)腎上主動(dòng)脈形狀對(duì)腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)行分型，觀察各組腹主動(dòng)脈瘤不同型的構(gòu)成情況。為了明確apoE基因敲除雄性小鼠體內(nèi)存在有效血藥濃度，我們采用了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相繼測(cè)定了瑞蘇伐他汀和阿托伐他汀的血清濃度。應(yīng)用了WakoLabAssayTMClolesterol試劑盒測(cè)定了三組的血清總膽固醇濃度；應(yīng)

7、用小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1ELISA試劑盒測(cè)定了三組的血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1濃度；應(yīng)用小鼠巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子ELISA試劑盒測(cè)定了三組的血清巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子濃度；應(yīng)用EnFace技術(shù)分析三組主動(dòng)脈弓粥樣硬化面積的絕對(duì)值與占內(nèi)膜面積的百分比。應(yīng)用圖像分析軟件ImagePro5.0分析三組主動(dòng)脈根部每10um與每80um的粥樣硬化斑塊面積，比較瑞蘇伐他汀與阿托伐他汀對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的apoE基因敲除雄性小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響

8、。應(yīng)用MicroProbe手動(dòng)染色系統(tǒng)對(duì)主動(dòng)脈根部的粥樣硬化斑塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的方法，以人工免疫染色分級(jí)的方法顯示其中的血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞的變化，從而闡述瑞蘇伐他汀與阿托伐他汀對(duì)粥樣硬化斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞組分的不同影響.應(yīng)用原位雜交檢測(cè)了主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊內(nèi)的PPAR-αmRNA、PPAR-γmRNA、MCP-1mRNA、TNF-αmRNA、NF-KappaBp50mRNA、NF-KappBp65mR

9、NA，從分子水平探討瑞蘇伐他汀與阿托伐他汀對(duì)抗炎因子與促炎因子的影響，從而說明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥狀態(tài)的改變。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的apoE基因敲除雄性小鼠的腹主動(dòng)脈瘤與動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型是一個(gè)成功的模型。在本次研究中，三組小鼠的體重、血壓在同時(shí)段比較無顯著性差異。比較植入含有血管緊張素Ⅱ的ALZET(R)滲透泵前后，血壓有明顯升高，說明血管緊張素Ⅱ使小鼠的血壓升高，這可能對(duì)apoE基因敲除雄

10、性小鼠的動(dòng)脈瘤與動(dòng)脈粥樣硬化的形成有協(xié)助作用，但是該血壓不受瑞蘇伐他汀和阿托伐他汀的影響。通過用高效液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定瑞蘇伐他汀和阿托伐他汀的血清濃度，我們得出瑞蘇伐他汀組與阿托伐他汀組均有相應(yīng)的血藥濃度。通過腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率與破裂的情況，用高頻超聲成像系統(tǒng)測(cè)定腎上主動(dòng)脈的最大內(nèi)直徑與最大橫斷面積，分析腹主動(dòng)脈瘤的分型構(gòu)成比。我們認(rèn)為瑞蘇伐他汀與阿托伐他汀均未能改變血管緊張素Ⅱ所誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展。通過測(cè)量三組的主動(dòng)脈弓與主

11、動(dòng)脈根部的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的apoE基因敲除的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的模型上，阿托伐他汀有抗動(dòng)脈粥樣硬化的效果，卻未見瑞蘇伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化的效果。
　　 我們從細(xì)胞與分子水平來探討了阿托伐他汀在本模型中抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制。通過對(duì)主動(dòng)脈根部的粥樣硬化斑塊內(nèi)細(xì)胞組分進(jìn)行免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)：阿托伐他汀改變了粥樣硬化斑塊內(nèi)的細(xì)胞組分，增加了中膜的血管平滑肌細(xì)胞的含量，減少了巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的聚集。通

12、過原位雜交方法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)促炎因子的轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50mRNA、NF-κBp65mRNA、MCP-1mRNA、TNF-αmRNA，及抗炎因子的轉(zhuǎn)錄因子PPAR-αmRNA和PPAR-γmRNA，阿托伐他汀顯著下調(diào)了促炎因子的轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50mRNA、NF-κBp65mRNA、MCP-1mRNA、TNF-αmRNA的豐度，上調(diào)了抗炎因子的轉(zhuǎn)錄因子PPAR-αmRNA和PPAR-γmRNA的豐度。但是瑞蘇伐他汀與阿托

13、伐他汀對(duì)循環(huán)中的炎癥因子MCP-1與MIF均無影響，對(duì)循環(huán)中的血清總膽固醇濃度亦無影響，這說明在本研究中阿托伐他汀的抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的效果是直接影響粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥狀態(tài)而發(fā)揮作用的，與循環(huán)中的炎癥狀態(tài)無關(guān)，獨(dú)立于調(diào)脂作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1.瑞蘇伐他汀與阿托伐他汀均未能阻止與逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)apoE基因敲除雄性小鼠的腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生與進(jìn)展。
　　 2.阿托伐他汀對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的apoE基因敲

14、除雄性小鼠有明確的抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的效果，而瑞蘇伐他汀的效果卻不明顯。
　　 3.阿托伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的效果與增加了血管中膜的平滑肌細(xì)胞的含量，減少了斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的聚集有關(guān)。
　　 4.阿托伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的效果與斑塊內(nèi)的抗炎因子上調(diào)、促炎因子下調(diào)有關(guān)，與循環(huán)中的炎癥因子無關(guān)，且獨(dú)立于調(diào)脂作用。
　　 5.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的apoE基因敲除雄性小鼠的腹主動(dòng)脈瘤與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的實(shí)