原發(fā)性膽汁性肝硬化相關(guān)單抗1F9的抗原分離與鑒定.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一種由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的、以肝內(nèi)小膽管進行性破壞性、非化膿性炎癥為特點的慢性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病，病程呈進行性，可發(fā)展至肝纖維化、肝硬化。近年來，由于對PBC認識程度和疾病診斷水平的提高，PBC檢出率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，作為非病毒性肝病，PBC的危害不容忽視。目前認為，PBC發(fā)病是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，但具體機制仍未闡明。由于

2、PBC病人多表現(xiàn)為膽汁排泄障礙，嘗試從膽汁排泄角度入手尋找與 PBC發(fā)病相關(guān)的新分子。
　　肝細胞是一種極性細胞，其膽管側(cè)細胞膜上存在著多種特異性表達分布的酶、骨架蛋白、通道蛋白、離子交換體和轉(zhuǎn)運體，共同參與肝細胞物質(zhì)運輸及膽汁排泄。有研究顯示，PBC患者肝細胞膽管側(cè)細胞膜極性分子存在結(jié)構(gòu)和功能異常。
　　1F9單克隆抗體是本課題組前期以 PBC患者肝細胞膽管側(cè)膜性組分為免疫原，利用單克隆抗體技術(shù)篩選獲得的PBC相關(guān)單克隆抗

3、體之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，該單抗所識別的抗原在正常肝臟組織中呈極性分布，主要位于肝細胞膽管側(cè)；PBC患者肝臟組織中1F9抗原的表達隨疾病進展逐漸增強，且部分患者中1F9抗原極性消失、分布紊亂，提示1F9抗原可能對PBC病理診斷具有重要意義。由于對1F9抗原認識有限，很大程度上限制了后續(xù)深入研究。因此，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進一步明確1F9抗原與PBC的相關(guān)性，分離并鑒定1F9抗原，為后續(xù)機制研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　

4、　1、進一步明確1F9抗原與PBC的相關(guān)性；2、分離、鑒定1F9抗原。
　　方法：
　　1、采用免疫組織化學(xué)，研究1F9抗原在正常肝臟、PBC、乙型病毒性肝炎、藥物性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病，共6種肝臟組織標本中的表達與分布，進一步明確1F9抗原與PBC的相關(guān)性。
　　2、檢測并分析1F9單抗亞型，輕、重鏈可變區(qū)序列及二級空間結(jié)構(gòu)；采用蛋白組學(xué)技術(shù)包括免疫沉淀、SDS-PAGE凝膠電泳和質(zhì)譜分析（MALDI

5、-TOF-TOF及LC-MS/MS），分離、鑒定1F9候選抗原。
　　3、通過免疫沉淀產(chǎn)物Western blot分析，驗證1F9單抗與LAMP2單抗對對方抗原的交叉識別；通過連續(xù)組織切片免疫組化檢測，觀察1F9抗原與LAMP2在多種正常組織及PBC疾病組織中的表達與分布；通過免疫熒光/激光共聚焦，觀察1F9抗原與LAMP2在細胞中的共定位情況；通過真核表達系統(tǒng)，觀察1F9單抗對外源LAMP2蛋白的識別；通過免疫電鏡技術(shù)，觀察1F

6、9抗原與LAMP2在正常肝臟及PBC疾病狀態(tài)下的亞細胞定位。
　　結(jié)果：
　　1、對來源于2006年至2012年第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科的正常肝臟組織32例、PBC174例、乙型病毒性肝炎87例、藥物性肝病44例、酒精性肝病23例、非酒精性脂肪性肝病53例，共6種石蠟包埋的肝臟組織標本進行切片、染色，觀察1F9抗原在不同肝臟組織中的表達與分布。免疫組化結(jié)果顯示，正常肝臟中，1F9抗原呈極性分布，主要位于肝細胞膽管側(cè)；無膽汁

7、淤積的肝臟疾病（乙型病毒性肝炎、藥物性肝病、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝?。┲?，1F9抗原的表達與正常肝臟無明顯變化；PBC患者肝臟中，1F9抗原的表達隨疾病進展逐漸增強，約51％（88/174）的患者中1F9抗原呈現(xiàn)不同程度地分布紊亂、極性消失，彌漫性分布于肝細胞胞漿中，提示1F9抗原與PBC密切相關(guān)。
　　2、1F9單抗亞型為IgG1/κ，輕、重鏈可變區(qū)序列及二級結(jié)構(gòu)已明確。肝癌細胞系HepG2和腎小管上皮細胞系HK2中1F9

8、抗原呈陽性表達。選擇HepG2和HK2兩株細胞系，利用1F9單抗進行免疫沉淀富集1F9抗原，免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后分別進行銀染和Western blot驗證。銀染結(jié)果顯示，兩株細胞系中均成功富集到～110kDa的蛋白帶，Western blot證實該蛋白帶可被1F9單抗特異性識別。分別對兩株細胞系中富集到的～110kDa蛋白帶進行切膠、酶解，同時利用兩種質(zhì)譜分析方法MALDI-TOF-TOF和LC-MS/MS進行檢

9、測，通過生物信息學(xué)檢索，結(jié)合分子量、組織分布等信息，獲得1F9候選抗原 Lysosome-associated membrane glycoprotein2（LAMP2）。
　　3、經(jīng)鑒定，現(xiàn)已明確1F9抗原為LAMP2：①HepG2和HK2兩株細胞系中，1F9單抗免疫沉淀的蛋白可被1F9單抗、LAMP2單抗特異性識別，而不能被LAMP1（LAMP1為LAMP2同源分子）單抗識別；同時，LAMP2單抗免疫沉淀的蛋白也可被1F9單抗

10、、LAMP2單抗特異性識別，且不能被LAMP1單抗識別；②免疫組化結(jié)果顯示，1F9抗原和LAMP2在多種連續(xù)正常組織及PBC組織中的表達、分布相似；③免疫熒光/激光共聚焦結(jié)果證實， HepG2和HK2細胞系中，1F9抗原與LAMP2呈現(xiàn)良好的共定位現(xiàn)象；④犬腎上皮細胞系MDCK中1F9抗原和LAMP2均不表達，分別將LAMP1質(zhì)粒和LAMP2質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MDCK細胞，提取細胞總蛋白進行Western blot分析，結(jié)果顯示1F9單抗可以

11、識別外源表達的LAMP2蛋白，而不能識別外源表達的LAMP1蛋白；⑤免疫電鏡結(jié)果顯示，正常肝臟中，1F9抗原與LAMP2定位相似，主要分布于肝細胞膽管側(cè)細胞膜附近的囊泡膜，囊泡直徑大小從50至400納米不等；PBC患者肝組織中，LAMP2表達增強、分布紊亂的特點也與1F9抗原相似，具體表現(xiàn)為：PBC中，囊泡數(shù)量明顯增多，標記有膠體金顆粒的囊泡彌漫性分布于整個細胞漿，且膠體金顆粒除分布于囊泡膜外，囊泡腔內(nèi)也出現(xiàn)膠體金顆粒聚集，同時，肝細胞

12、胞漿內(nèi)還存在一部分與囊泡毫無關(guān)系的可溶性LAMP2分子（散在分布的膠體金顆粒）。
　　結(jié)論：
　　本研究進一步證實了1F9抗原與PBC的相關(guān)性：①PBC患者肝臟中，1F9抗原表達增強；②1F9抗原表達增強與PBC病理分級正相關(guān)；③51％（88/174）的PBC患者肝臟中，1F9抗原呈現(xiàn)不同程度地分布紊亂、極性消失。
　　本研究明確了1F9單抗亞型，輕、重鏈可變區(qū)序列及二級空間結(jié)構(gòu)，并最終證實1F9抗原為 LAMP2：①

13、通過免疫沉淀——質(zhì)譜分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS方法）策略，獲得1F9候選抗原LAMP2；②通過免疫沉淀產(chǎn)物Western blot分析，證實1F9單抗與LAMP2單抗可以相互識別對方抗原；③通過連續(xù)組織切片免疫組化檢測，證實1F9抗原與LAMP2在多種正常組織和PBC疾病組織中的表達、分布一致；④通過免疫熒光/激光共聚焦，證實1F9抗原與LAMP2在細胞系中共定位良好；⑤通過LAMP2真核表達產(chǎn)物Western