應(yīng)用OWLS研究靶序列二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)固-液界面NDA雜交動(dòng)力學(xué)的影響.pdf

1、目的:
　　 基因芯片技術(shù)自上世紀(jì)80年代初誕生以來,以其高通量、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn),取得了長足的發(fā)展。特別是在基因表達(dá)譜分析、測序、基因突變檢測、SNP檢測、臨床疾病診斷等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。然而現(xiàn)階段基因芯片技術(shù)存在的瓶頸問題是基因芯片雜交結(jié)果重復(fù)性較差,限制了其發(fā)展和臨床應(yīng)用。我們利用OWLS非標(biāo)記檢測技術(shù)觀測到當(dāng)靶序列長于探針序列時(shí),由于靶序列及其與探針雜交后的游離端在溶液中會(huì)形成立體結(jié)構(gòu),而具有立體結(jié)構(gòu)的靶序列分

2、子的熱力學(xué)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng),不僅影響雜交體的形成,還會(huì)使雜交體的解離常數(shù)增加,甚至使雜交體不能穩(wěn)定存在。靶序列分子結(jié)構(gòu)是影響雜交動(dòng)力學(xué)的重要因素。
　　 OWLS能夠提供一個(gè)溫度可調(diào)(T變化小于0.1℃)的恒溫外循環(huán)雜交體系平臺(tái),其外接的微流體控制系統(tǒng)能夠不斷地將預(yù)先注入樣品池的樣品補(bǔ)充到雜交反應(yīng)池內(nèi),維持雜交反應(yīng)池內(nèi)在雜交過程中靶序列濃度相對(duì)恒定。且OWLS是非標(biāo)記的檢測方法,通過實(shí)時(shí)檢測雜交信號(hào)NTE和NTM的變化,應(yīng)用OWLS自身

3、轉(zhuǎn)換軟件將NTE或NTM換算成Mass、dM/dT(M)等與動(dòng)力學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)結(jié)果并通過屏幕多個(gè)窗口一同顯示,從而研究人員可以實(shí)時(shí)監(jiān)測雜交動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)過程。
　　 本課題的目的是研究不同類型靶核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶核酸熱力學(xué)擴(kuò)散對(duì)固/液界面核酸雜交動(dòng)力學(xué)過程的影響。研究的意義在于探明不同靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)在一定條件下與已知序列探針的雜交動(dòng)力學(xué)影響的規(guī)律,從而為基因芯片探針設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　

4、 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 HBV特異基因片段(C亞型)(由本實(shí)驗(yàn)室篩選合成)
　　 OWLSTM120(MicroVacuumLtd,Hungary)
　　 熒光圖像掃描儀(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA)
　　 202-0數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(上海陽光試驗(yàn)儀器公司)
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)探針和靶序

5、列
　　 2、熒光標(biāo)記法確定探針及靶序列最佳雜交濃度
　　 3、用接觸式點(diǎn)樣方法在芯片上固定探針
　　 4、化學(xué)法再生傳感器芯片
　　 5、光波導(dǎo)模式譜法(OWLS)檢測傳感器芯片表面探針結(jié)合靶序列的質(zhì)量變化
　　 結(jié)果:
　　 1、探針及靶序列的設(shè)計(jì):以HBV的C亞型基因?yàn)槟０?應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件,設(shè)計(jì)三組探針和不同長度的靶序列,并應(yīng)用Mfold軟件預(yù)測3組探針和靶

6、序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 2、探針及靶序列最佳雜交濃度的確定:探針的濃度確定為25μM:靶序列的濃度確定為2μM。
　　 3、SchiffBase鍵的穩(wěn)定性:未經(jīng)硼氫化鈉處理的探針與靶序列T75雜交形成的雜交體,能夠使探針從芯片上脫落,導(dǎo)致OWLS基線下移,表明SchiffBase鍵不穩(wěn)定,在一定條件下,會(huì)斷裂。
　　 4、利用OWLS獲得相同面密度探針與長度不同靶序列雜交動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù):相同面密度的探針與不同二級(jí)結(jié)構(gòu)

7、的靶序列雜交結(jié)合速率常數(shù)和靶序列洗脫率差異顯著,主要是由于靶序列二級(jí)結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。靶序列二級(jí)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,表觀速率常數(shù)越小,靶序列洗脫率越大。
　　 結(jié)論:
　　 1、SchiffBase鍵不穩(wěn)定。
　　 2、應(yīng)用OWLS研究相同面密度的探針與不同長度的靶序列雜交動(dòng)力學(xué)過程,探針與靶序列雜交反應(yīng)的表觀速率常數(shù)、結(jié)合靶序列摩爾數(shù)之間存在很大差異,靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)是影響以上動(dòng)力學(xué)參數(shù)的關(guān)鍵因素。
　　 3、影