利用OWLS研究二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)固液界面DNA雜交動(dòng)力學(xué)的影響.pdf

1、目的：
　　 基因芯片技術(shù)自上世紀(jì)末誕生以來，取得迅速發(fā)展，并已廣泛應(yīng)用到了基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測(cè)、遺傳病相關(guān)基因分析、藥物篩選、基因測(cè)序、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等多個(gè)領(lǐng)域。盡管所有的基因芯片都是基于DNA鏈的雜交，但這種設(shè)計(jì)間的不同卻產(chǎn)生了較大結(jié)果差異。由于基因芯片復(fù)雜性較高，使得基因芯片的重復(fù)性差、特異性不高。
　　 OWLS(Optical Waveguide L

2、ightmode Spectroscopy)提供了一個(gè)可調(diào)溫度的雜交平臺(tái)，并能不斷補(bǔ)充雜交損耗的靶序列分子，保證雜交液中靶序列濃度穩(wěn)定。且OWLS采用非標(biāo)記的檢測(cè)方法，連續(xù)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度，避免引入其他因素干擾雜交結(jié)果。另外，OWLS的傳感器芯片與國內(nèi)外生產(chǎn)的基因芯片的片基一致，保證了我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性。
　　 本研究的目的是利用OWLS分析探針和靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及探針和靶序列之間的錯(cuò)配對(duì)基因芯片雜交過程的影響。進(jìn)而完善基因

3、芯片設(shè)計(jì)方法，提高基因芯片的重復(fù)性。
　　 方法：
　　 1、軟件設(shè)計(jì)
　　 設(shè)計(jì)3對(duì)具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針及靶序列，并用Mfold軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 2、熒光標(biāo)記法確定最佳雜交濃度
　　 探針濃度的選擇
　　 分別將不同濃度的探針固定于芯片表面后，用5μMCy5標(biāo)記的靶序列進(jìn)行雜交1h后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。
　　 靶序列濃度的選擇
　　 用10μM的探針構(gòu)建芯片后，

4、分別用不同濃度的Cy5標(biāo)記的靶序列進(jìn)行雜交1h后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。
　　 3、化學(xué)法再生傳感器芯片
　　 分別用0.4％SDS和0.1％NaOH處理雜交后的傳感器芯片，再雜交后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。
　　 4、光波導(dǎo)模式譜法(OWLS)監(jiān)測(cè)傳感器芯片
　　 靶序列與固定在芯片表面的探針分別進(jìn)行短時(shí)間雜交(0.5h)及完全雜交(大于7h)后，用OWLS檢測(cè)傳感器芯片表面探針結(jié)合靶序列的質(zhì)量變化。
　　

5、結(jié)果：
　　 1、探針及靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)
　　 應(yīng)用Mfold軟件成功預(yù)測(cè)3對(duì)探針及靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在37℃條件下，一對(duì)探針及靶序列無固定二級(jí)結(jié)構(gòu)；另一對(duì)形成較少的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；第三對(duì)形成較多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　 2、最佳雜交條件
　　 探針的濃度確定為10μM;靶序列的濃度確定為1μM。
　　 3、傳感器芯片的最佳再生條件
　　 0.1％NaOH處理芯片0.5h可有效地使傳感器芯片再生。該芯

6、片反復(fù)雜交5次后，熒光信號(hào)強(qiáng)度沒有明顯變化，表明傳感器芯片具有再生穩(wěn)定性。
　　 4、形成雜交復(fù)合物的質(zhì)量與速率常數(shù)
　　 短時(shí)間雜交后，具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針及靶序列在傳感器芯片表面形成復(fù)合物的質(zhì)量有明顯差異，而經(jīng)完全雜交后，形成復(fù)合物的質(zhì)量沒有明顯差異，但隨著二級(jí)結(jié)構(gòu)的增加，雜交速率降低。
　　 結(jié)論：
　　 探針與靶序列完全雜交后，探針和靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)不會(huì)影響最終在芯片表面形成復(fù)合物的質(zhì)量。保證其