尿源性干細(xì)胞復(fù)合聚己內(nèi)酯-明膠電紡納米支架修復(fù)皮膚組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.研究從人類尿液分離的尿源性干細(xì)胞(UDSCs)的生物學(xué)特性,為再生醫(yī)學(xué)研究提供新型且豐富的種子細(xì)胞來(lái)源;2.構(gòu)建UDSCs復(fù)合聚己內(nèi)酯/明膠(PCL/GT)電紡納米纖維膜的組織工程皮膚,評(píng)價(jià)其對(duì)家兔全層皮缺損傷口的修復(fù)功能。
　　方法:1. UDSCs生物學(xué)特性觀察
　　1.1 LMM101培養(yǎng)基貼壁篩選法從健康人體尿液中分離培養(yǎng)UDSCs;
　　1.2 UDSCs表面標(biāo)記物鑒定:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面抗原CD2

2、9、CD73、CD90、CD146、CD34和 HLA-DR等的表達(dá)情況;
　　1.3 UDSCs多向分化能力鑒定:采用成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別對(duì)UDSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),并分別用茜素紅、油紅O和甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色鑒定;
　　2.PCL/GT電紡納米纖維膜的制備:將聚己內(nèi)酯(poly(?-caprolactone),PCL)和明膠(Gelatin,GT)混合電紡制得混合納米纖維膜。通過(guò)傅立葉紅外光譜、接觸角、楊氏模量、體

3、外降解速率對(duì)材料進(jìn)行表征。
　　3. PCL/GT電紡納米纖維膜生物相容性觀察:將UDSCs細(xì)胞種植于PCL/GT納米纖維膜上,利用CCK-8法檢測(cè)UDSCs增殖能力;活/死細(xì)胞染色方法觀察UDSCs在PCL/GT支架材料表面的存活率。并對(duì)UDSCs復(fù)合PCL/GT支架進(jìn)行掃描電鏡(SEM)觀察。
　　4.UDSCs復(fù)合PCL/GT支架的構(gòu)建及體內(nèi)移植:
　　4.1將4-6代UDSCs進(jìn)行GFP+慢病毒感染標(biāo)記后,接種

4、于PCL/GT支架上進(jìn)行體內(nèi)移植;
　　4.2全層皮膚缺損模型及移植實(shí)驗(yàn):在新西蘭大白兔背部手術(shù)操作面積為2cm×2cm的皮膚全層缺損創(chuàng)面,隨機(jī)分別以(GFP+)UDSCs-PCL/GT復(fù)合膜、PCL/GT覆蓋,覆蓋紗布組為對(duì)照組。于14day觀察創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算創(chuàng)面的愈合率。取創(chuàng)面及創(chuàng)面周圍組織做冰凍切片, HE染色和Masson’s三色染色后觀察皮膚結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞免疫熒光觀察表皮組織,新生血管變化及(GFP+)UDSCs在體

5、內(nèi)的生存情況。
　　5. UDSCs復(fù)合PCL/GT支架修復(fù)皮膚損傷的作用機(jī)制:通過(guò)CCK-8法、實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)(RTCA,Real Time Cellular Analysis)、劃痕實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)觀察UDSCs條件培養(yǎng)基對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖、遷移及成管能力的影響,以進(jìn)一步分析UDSCs修復(fù)皮膚損傷的機(jī)制。
　　結(jié)果:1.從人類的新鮮尿液中成功分離培養(yǎng)出UDSCs。UDSCs細(xì)胞接種后3-8

6、天開(kāi)始貼壁生長(zhǎng),8-12天后細(xì)胞呈集落生長(zhǎng),經(jīng)過(guò)2-3周傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)呈均一的成纖維細(xì)胞樣。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代UDSCs,結(jié)果顯示表達(dá)CD29、CD73、CD90和CD146,不表達(dá)CD34,HLA-DR。表明UDSCs符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。體外采用成骨、成脂和成軟骨培養(yǎng)基分別對(duì)UDSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),在21天,成骨誘導(dǎo)茜素紅染色呈陽(yáng)性。在14天,成脂誘導(dǎo)油紅“O”染色呈陽(yáng)性。在28天,成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞呈球狀團(tuán)塊生長(zhǎng),冰凍切片后,

7、甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性。結(jié)果表明UDSCs在體外具有成骨、成脂和成軟骨的分化潛能。
　　2.成功制備了PCL/GT混合納米纖維膜:通過(guò)紅外分析明膠的氮?dú)滏I(N-H)變形振動(dòng)吸收峰在1500-1550 cm-1和1600-1650 cm-1處被觀察到, PCL或明膠中的碳氧雙鍵(C=O)的特征吸收峰在1700-1760 cm-1處被觀察到,表明已經(jīng)成功制備了PCL/GT混合納米纖維膜,接觸角檢測(cè)結(jié)果表明,在25℃室溫下,PCL纖維支架對(duì)

8、水接觸角為109°±0.4°,通過(guò)混紡后,PCL/GT纖維支架接觸角減小到接近0°,表明電紡入GT纖維可以增強(qiáng)PCL薄膜的親水性,有利于提高PCL纖維膜材料的生物相容性。楊氏模量的結(jié)果顯示PCL/GT纖維的力學(xué)性能和人皮膚組織很接近。在模擬體液中PCL/GT在6周后失重率達(dá)到了90％以上,而PCL膜6周后失重率不到5%,表明有明膠纖維降解的微環(huán)境能促進(jìn)復(fù)合膜中PCL纖維的降解。
　　3.SEM和活/死細(xì)胞染色結(jié)果顯示,培養(yǎng)7天后,

9、UDSCs在PCL/GT膜上黏附,呈現(xiàn)各種形態(tài)并向材料內(nèi)部遷移生長(zhǎng),細(xì)胞生存狀態(tài)良好。CCK-8法結(jié)果表明UDSCs在PCL/GT支架上增殖效率較好。表明PCL/GT支架具有良好的生物相容性。
　　4. UDSCs-PCL/GT具有顯著促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的作用。在14天,兔創(chuàng)面收縮率,UDSCs-PCL/GT組>PCL/GT組(p<0.05)>對(duì)照組(p<0.05);HE染色和Masson染色結(jié)果表明UDSCs-PCL/GT組相比較

10、于PCL/GT組和對(duì)照組,皮膚結(jié)構(gòu)完整,創(chuàng)面上皮化程度高,新生膠原纖維面積大(p<0.01)且排列整齊,可見(jiàn)基本發(fā)育完整的皮膚附件即新生致密毛囊。從細(xì)胞免疫熒光的染色結(jié)果觀察到, UDSCs-PCL/GT組的表皮面積比PCL/GT組大(p<0.01),與對(duì)照組相比存在顯著的差異(p<0.01)。在7天和14天,UDSCs-PCL/GT組的新生血管密度相比于PCL/GT組和對(duì)照組均存在顯著的差異(p<0.01)。熒光顯微鏡下觀察到傷口組織

11、在7天廣泛表達(dá)(GFP+)UDSCs,在14天未見(jiàn)表達(dá)。提示UDSCs有可能是通過(guò)干細(xì)胞的旁分泌機(jī)制促進(jìn)了血管新生從而促進(jìn)損傷的修復(fù)。
　　5. UDSCs條件培養(yǎng)基可促進(jìn)HUVECs增殖、遷移,并提高HUVECs的成管能力。CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明UDSCs條件培養(yǎng)基能明顯提高HUVECs增殖效率;RTCA和劃痕實(shí)驗(yàn)表明UDSCs條件培養(yǎng)基能影響HUVECs,促進(jìn)其遷移;成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到UDSCs條件培養(yǎng)基提高了毛細(xì)血管管腔形成

12、數(shù)量。表明UDSCs旁分泌因子與HUVECs的血管生成能力有關(guān)。
　　結(jié)論:1.本研究建立了對(duì)UDSCs的分離培養(yǎng)技術(shù),其生物學(xué)特性符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征,其具有來(lái)源豐富、取材無(wú)創(chuàng)及可來(lái)源于自體等優(yōu)勢(shì),有望成為再生醫(yī)學(xué)新的種子細(xì)胞來(lái)源;2.本研究制備的PCL/GT納米纖維支架具有良好的力學(xué)性能和生物相容性,符合皮膚組織工程支架材料的要求;3.UDSCs復(fù)合PCL/GT納米纖維膜具有顯著促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)干