純鈦表面加載RGD多肽的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：鈦種植體與骨界面之間形成的骨結(jié)合，是種植修復(fù)成功的關(guān)鍵。本研究擬先在純鈦表面采用兩步陽(yáng)極氧化法形成雙層蜂窩狀TiO2納米管，然后用聚多巴胺處理納米管表面，同時(shí)向外接枝偶聯(lián)RGD多肽，構(gòu)建TiO2納米管-聚多巴胺-RGD多肽生物活性層，體外評(píng)價(jià)該活性層對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的黏附、增殖和分化的影響，以期為鈦種植體表面生物改性提供新的思路。
　　材料與方法：1，鈦片預(yù)處理及制備TiO2納米管：厚度0.25 mm的純鈦

2、箔片加工成直徑為12 mm的鈦片，金相砂紙（800目到7000目）逐級(jí)打磨拋光至鏡面狀，丙酮、乙醇、去離子水中依次超聲清洗20min，氮?dú)饬髦写蹈?。繼而將上述鈦片放入盛有88 mmol/L氟化銨的乙二醇電解液中，鈦片作陽(yáng)極，石墨作陰極，分兩步陽(yáng)極氧化：第一步先在60伏電壓下通電2.5小時(shí)，取出鈦片放入去離子水中，超聲震蕩去除鈦片表面陽(yáng)極化形成的氧化膜；第二步改在12伏電壓下通電40分鐘，取出鈦片，去離子水中超聲清洗至溶液澄清，氮?dú)饬髦写?/p>

3、干，備用。2，多巴胺修飾及加載RGD多肽：電化學(xué)修飾后的鈦片，浸泡于50ml、2mg/ml多巴胺溶液中12小時(shí)，避光，保持周圍氣流通暢。取出修飾后的鈦片，去離子水中反復(fù)沖洗去除表面未聚合殘余的多巴胺，室溫下自然晾干。將上述鈦片再浸泡于30ml、200?g/ml RGD多肽溶液中，37℃恒溫?fù)u床上12小時(shí)，取出處理后的鈦片，去離子水中反復(fù)沖洗去除表面未結(jié)合牢固殘余的多肽，室溫下自然晾干。3，實(shí)驗(yàn)分組：打磨拋光的鈦片作為光滑組，陽(yáng)極氧化處理

4、的鈦片作為TiO2納米管組，在TiO2納米管基礎(chǔ)上多巴胺浸泡修飾的鈦片作為多巴胺組，通過(guò)多巴胺接枝偶聯(lián)RGD多肽的鈦片作為RGD多肽組。4，表面形貌和元素組成檢測(cè)：采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM）、X射線光電子能譜（XPS）對(duì)各組鈦片進(jìn)行表面形貌和元素組成分析。5，體外細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)：體外將修飾后鈦試件與小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)TiO2納米管-聚多巴胺-RGD多肽活性層對(duì)BMSCs的黏附、增殖和分化的影響。
　　結(jié)果：1，F(xiàn)ES

5、EM顯示，光滑組表面比較粗糙，有清晰可見(jiàn)的的劃痕；TiO2納米管組表面為蜂窩狀多孔的TiO2納米管，外管為六邊形，內(nèi)、外管直徑分別在約20、160nm；多巴胺組表面納米管管徑部分變窄或被封閉；RGD多肽組表面可見(jiàn)散落顆粒狀的RGD多肽，部分進(jìn)入納米管中。2，細(xì)胞粘附：光滑組細(xì)胞生長(zhǎng)一般，胖梭形，鋪展較局限。TiO2納米管組細(xì)胞鋪展較開(kāi)，但是細(xì)胞之間的觸角較少。多巴胺組和RGD多肽組細(xì)胞生長(zhǎng)鋪展良好，細(xì)梭形，細(xì)胞伸出的觸角較多，且RGD多

6、肽組細(xì)胞之間接觸比多巴胺組更多。3，細(xì)胞增殖：4組在第1天增值活力有增加的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與光滑組比較，TiO2納米管組，多巴胺組，RGD多肽組在第3天和第5天增殖活力增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與TiO2納米管組、多巴胺組分別比較，RGD多肽組在第3天和第5天增殖活力增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4，細(xì)胞分化：4組在第3天和第5天AKP活力有增加的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天時(shí)，與光滑組比較，TiO2納