葉酸預(yù)防胎源性子宮內(nèi)膜異位癥易感基因HOXA10異常甲基化的研究.pdf

1、研究背景：
　　 子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）是一種激素依賴性的女性常見疾病，發(fā)病率逐年上升，病因迄今不明。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)異癥是一種表觀遺傳學(xué)疾病，DNA甲基化是最重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)在DNA甲基化過程起主要調(diào)控作用。HOXA10基因內(nèi)異癥易感基因之一，一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其異常甲基化模式與內(nèi)異癥生物學(xué)行為和預(yù)后相關(guān)。妊娠期飲食能對子代基因組產(chǎn)生長期影響，葉酸是人體中必需的維生素，參與人體

2、新陳代謝的全過程，是合成人體DNA的必需維生素，并與細(xì)胞分化、倍增及其功能密切相關(guān)，對人類孕育生命影響重大。葉酸作為人體內(nèi)甲基基團(tuán)的最終來源，在維持DNA甲基化中起著重要的作用。臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)母體葉酸缺乏或代謝異常與胚胎發(fā)育異常密切相關(guān)，孕前和孕期補(bǔ)充葉酸可預(yù)防或減少子代出生缺陷的發(fā)病率。但內(nèi)異癥作為表觀遺傳疾病，內(nèi)異癥孕婦與正常孕婦未予葉酸干預(yù)其女性子代內(nèi)異癥易感基因H OXA10甲基化是否存在差異及內(nèi)異癥孕婦服用葉酸是否影

3、響子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10的甲基化狀態(tài)，目前尚未見相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)。
　　 目的：
　　 本研究旨在比較內(nèi)異癥孕婦與正常孕婦未予葉酸干預(yù)的情況下，其女性子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10異常甲基化率是否存在差異，并且通過比較內(nèi)異癥孕婦補(bǔ)充葉酸是否影響女性子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10異常甲基化水平，了解葉酸在優(yōu)化宮內(nèi)環(huán)境的作用，為如何預(yù)防“成人疾病胎兒起源”提供線索。
　　 方法：
　　 1.標(biāo)本來源:新生

4、兒臍帶血標(biāo)本來自2010年至2012年南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科和惠州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，新生兒為女性者入選本研究，內(nèi)異癥患者均經(jīng)孕前手術(shù)病理診斷或剖宮產(chǎn)術(shù)后病理診斷，孕婦孕前及孕期有無服用葉酸屬于回顧性的分析。內(nèi)異癥孕婦新生兒臍血標(biāo)本36例，其中有21例自孕前至早孕3月服用葉酸0.4mg/d，15例孕前和孕期未服用葉酸，無內(nèi)異癥孕婦兒臍血標(biāo)本56例，其中有30例孕婦自孕前至早孕3月服用葉酸0.4mg/d，另26例孕婦孕前及孕期未服用葉酸

5、。分娩時(shí)用檸檬酸鈉抗凝管采集新生兒臍血2m1，置于-20℃低溫冰箱保存。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)細(xì)胞DNA磁珠提取試劑盒提取血液標(biāo)本基因組DNA;
　　 (2) DNA亞硫酸氫鹽處理;
　　 (3)利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)及亞硫酸氫鹽修飾后測序(BSP)分別檢測子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10啟動(dòng)區(qū)5'CpG的甲基化狀態(tài)。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)分析，各組間率的比較采用x2檢驗(yàn)和Fisher精確概率（樣本總數(shù)小于40或理論頻數(shù)小于5）檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP):甲基化特異性PCR檢測各組子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10的甲基化狀態(tài)，其中內(nèi)異癥未服葉酸組有6例新生兒臍血檢測到甲基化，發(fā)生甲基化率為40％(6/15)，正常未服葉酸組檢測到1例發(fā)生甲基化，發(fā)生甲基化率為3.8％(1/26)，兩組比較差異有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.782，P=0.006);內(nèi)異癥孕婦中服用葉酸組有1例新生兒臍血檢測到甲基化，發(fā)生甲基化率4.7％(1/21)，內(nèi)異癥未服葉酸組有6例新生兒臍血檢測到甲基化，發(fā)生甲基化率為40％(6/15)，兩組甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.937，P=0.013)。正常組服用葉酸檢出甲基化率為3.3％(1/30)，與正常未服用葉酸組甲基化率的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.011，P=1.0)。
　　 2.亞硫

8、酸氫鹽修飾后測序(BSP):亞硫酸氫鹽修飾后測序四組子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10的甲基化狀態(tài)，其中內(nèi)異癥未服用葉酸組有7例新生兒臍血檢測到甲基化，發(fā)生甲基化率為46.6％(7/15)，正常未服葉酸組檢測到1例發(fā)生甲基化3.8％(1/26)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=11.106，P=0.002);內(nèi)異癥孕婦中服用葉酸組有1例新生兒臍血檢測到甲基化，發(fā)生甲基化率為4.7％(1/21)，未服用葉酸組有7例新生兒檢測到甲基化，發(fā)生甲基

9、化率為46.6％(7/15)，兩組甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.890，P=0.005)。正常組服用葉酸檢出甲基化率為3.3％(1/30)，與正常組未服用葉酸甲基化率的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.011，P=1.0)。
　　 討論：
　　 近年隨著一系列臨床研究的不斷深入，遺傳學(xué)因素在內(nèi)異癥發(fā)病中的貢獻(xiàn)不斷得到證實(shí)。內(nèi)異癥患者的一級(jí)女性親屬罹患內(nèi)異癥的風(fēng)險(xiǎn)較非患病親屬顯著增高。目前研究通過對內(nèi)異癥病灶的染色

10、體和基因分析，證實(shí)HOXA10等多個(gè)位點(diǎn)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的存在高甲基化，并認(rèn)為HOXA10異常甲基化導(dǎo)致的HOXA10基因表達(dá)下降可能是內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制之一。
　　 在動(dòng)物模型中越來越多的證據(jù)表明，已經(jīng)觀察到對胎兒時(shí)期重編程產(chǎn)生影響的許多因素是受表觀遺傳所介導(dǎo)的。文獻(xiàn)有報(bào)道表觀遺傳修飾雖然不能改變DNA序列，但可遺傳至子代的。目前對其具有家族聚集性的研究主要集中在流行病學(xué)調(diào)查，目前尚無動(dòng)物或人體實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)從內(nèi)異癥的表

11、觀遺傳角度，利用甲基化特異性PCR法和亞硫酸鹽測序法檢測發(fā)現(xiàn)，在無葉酸干預(yù)的情況下，相對于正常孕婦的女性子代，內(nèi)異癥孕婦其女性子代的內(nèi)異癥易感基因HOXA10異常甲基化率顯著增加。進(jìn)一步提示內(nèi)異癥可能是一種具有家族聚集性的表觀遺傳學(xué)疾病。
　　 葉酸在基因的調(diào)控所需的甲基化過程中起重要的作用，人體無法合成葉酸，必須靠外源性供給，且妊娠期婦女的葉酸需求量增多，葉酸不足的情況嚴(yán)重，葉酸在體內(nèi)的主要功能是提供甲基供體參與DNA合成，它

12、在調(diào)節(jié)包括細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng)和保持基因組穩(wěn)定性方面具有重要的作用。近年來的研究認(rèn)為DNA甲基化與人類多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，DNMT作為甲基化的關(guān)鍵酶在腫瘤的發(fā)生過程中起重要作用，DNMT活性異常增高是抑癌基因高甲基化進(jìn)而表達(dá)失活的主要原因。有研究顯示，葉酸可影響DNMT的活性，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，DNMT在多種腫瘤和細(xì)胞中呈現(xiàn)高活性。有研究中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸后能抑制腫瘤病灶細(xì)胞的DNMT的活性，使其mRNA和蛋白表達(dá)下降。在王金桃等的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葉酸

13、可抑制DNMT1的表達(dá)和活性，從而使得抑癌基因P16高甲基化水平降低，進(jìn)而影響相關(guān)基因P16的表達(dá)。這些都進(jìn)一步葉酸狀態(tài)與體內(nèi)DNMT的活性和表達(dá)水平有關(guān)，說明體內(nèi)葉酸的水平可影響DNMT的活性和表達(dá)，從而影響DNA的甲基化水平。然而這種現(xiàn)象同樣在子宮內(nèi)膜的DNMTs得到證實(shí)，在Ding YB等的研究中發(fā)現(xiàn)在正常假孕小鼠胚胎種植時(shí)子宮內(nèi)膜DNMTs在正常水平，而給予低葉酸飲食的假孕小鼠內(nèi)膜的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B均升高，

14、這也說明葉酸可以影響子宮內(nèi)膜DNMTs的水平。同樣Wu等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜中3種甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1，ANMT3A和DNMT3B）基因均過度表達(dá)，內(nèi)異癥患者中存在DNA的異常甲基化。
　　 在人體受試者中發(fā)現(xiàn)，胎盤是母體血漿葉酸傳輸給胎兒的決定性因素，葉酸通過胎盤的葉酸受體傳輸，在胎兒血液中葉酸甚至是母體葉酸水平的幾倍。內(nèi)異癥作為表觀遺傳性疾病，補(bǔ)充葉酸能否預(yù)防內(nèi)異癥這類女性成人疾病的發(fā)生？在Sie KK等的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孕鼠在

15、孕期補(bǔ)充葉酸的，其子代DNA甲基化顯著降低，并且子代的大腸癌發(fā)生幾率下降了64％，說明葉酸能夠影響大鼠的宮內(nèi)環(huán)境而降低其子代患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 因此，針對這一胚胎甲基化重塑時(shí)期，我們的實(shí)驗(yàn)中研究內(nèi)異癥孕婦孕前及孕期補(bǔ)充與未補(bǔ)充葉酸，其女性子代內(nèi)異癥易感基因HOXA10異常甲基化的比較，在利用甲基化特異性PCR檢測到前者的異常甲基化率為4.7％，而后者為40％;兩者甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，利用亞硫酸鹽測序

16、法檢測到前者的異常甲基化率為4.7％，而后者為46.6％;兩者甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而正常組服用與未服用葉酸兩組的甲基化率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因可能為補(bǔ)充葉酸后通過抑制DNMT的活性和表達(dá)，繼而使得內(nèi)異癥易感基因HOXA10的甲基化水平降低。因此在妊娠早期糾正異常的甲基化狀態(tài)對于預(yù)防女性內(nèi)異癥成人類疾病可能具有深遠(yuǎn)的意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.孕婦無葉酸干預(yù)的情況下，內(nèi)異癥的孕婦其女性子代內(nèi)異