AB3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗免疫治療Tg-APPswe-PSEN1dE9鼠的研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(AD)的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力喪失和認(rèn)知能力減退,最核心病理特點(diǎn)為β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑,Aβ1-42是形成老年斑的主要成分,并且由Aβ沉積引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)在AD神經(jīng)變性過(guò)程中起著核心作用。Aβ疫苗免疫治療AD的機(jī)制就在于調(diào)控免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),多項(xiàng)研究提示Aβ疫苗接種能降低AD樣病理和改善認(rèn)知障礙,但是當(dāng)Aβ全肽段疫苗用于人類Ⅱ期臨床試驗(yàn)時(shí),因出現(xiàn)了致命的T細(xì)胞介導(dǎo)的腦膜腦炎被終止;Aβ1-42 N末

2、端片段Aβ1-42含激活B細(xì)胞的抗原決定簇,不誘發(fā)炎癥反應(yīng),選用Aβ1-42 N末端片段為抗原,避開了全肽段Aβ1-42的C末端的毒性肽,可以預(yù)防和治療AD,又避免誘發(fā)炎癥反應(yīng)。本研究采用已經(jīng)構(gòu)建的Aβ3-10重復(fù)10次片段的質(zhì)粒免疫正常Balb/c鼠及Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠,檢測(cè)Aβ3-10重復(fù)片段疫苗是否具備免疫原性,對(duì)Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的改善、腦內(nèi)Aβ沉積清除的影響、體外脾T淋巴細(xì)

3、胞增殖反應(yīng)及分泌細(xì)胞因子的影響、腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)及形態(tài)的變化與A B沉積的關(guān)系,闡述Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗免疫治療Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠的效果及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 質(zhì)粒菌液由導(dǎo)師提供,提取質(zhì)粒pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG、酶切反應(yīng)、測(cè)序。正常Balb/c鼠及12月齡Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠隨機(jī)分3組:Aβ1-42組、Aβ3-10組只、對(duì)照

4、組。正常Balb/c鼠按照0、2、4、8周免疫4次,12月齡Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠按照0、1、3、6、9、12周共免疫6次。通過(guò)眶后及腹主動(dòng)脈,其中每組2只小鼠的新鮮脾臟用于細(xì)胞培養(yǎng);分離小鼠大腦左右半球,左側(cè)大腦半球-70℃保存待檢;右側(cè)半球及分離后肺、肝、心臟、脾和腎臟等組織放入75％乙醇-甲醛中固定。檢測(cè)尿樣的膽紅素、酮體、維生素C、尿蛋白、潛血、pH、白細(xì)胞、比重等指標(biāo)。采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠的空間學(xué)習(xí)記

5、憶能力,分為隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分,記錄軌跡、潛伏期時(shí)間、穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)、穿越第Ⅰ象限次數(shù)、游泳距離、平均速度,和站臺(tái)周邊區(qū)域、站臺(tái)周邊區(qū)域一及中央游泳距離占總距離百分比等。采用ELISA方法檢測(cè)血清抗Aβ抗體。采用MTT法測(cè)定體外脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清及腦組織勻漿中的IL-4、IFN-γ水平。HE染色及普魯士藍(lán)染色檢測(cè)腦、肺、肝、心臟、脾和腎臟等組織。采用采用免疫組化SP法,檢測(cè)腦內(nèi)Aβ沉積及

6、抗GFAP陽(yáng)性細(xì)胞。應(yīng)用SPSS16.0軟件,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,差異顯著水平設(shè)為p＜0.05。
　　 結(jié)果:
　　 酶切及測(cè)序結(jié)果提示Aβ3-10重復(fù)10次片段與載體pcDNA3.1及真核表達(dá)增效劑CPG成功連接。免疫正常Balb/c鼠,第3次及第4次免疫后就檢測(cè)出抗Aβ抗體,抗體水平隨免疫次數(shù)增多而增加。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)提示Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒

7、與Aβ多肽免疫治療較對(duì)照組明顯改善學(xué)習(xí)及記憶能力,Aβ3-10組的總平均潛伏期、穿平臺(tái)次數(shù)及穿越第一象限次數(shù)都優(yōu)于Aβ1-42組,但差異不顯著。免疫過(guò)程血清抗Aβ抗體水平檢測(cè)顯示Aβ1-42組和Aβ3-10組的抗體水平隨著免疫接種次數(shù)增多逐漸增高,第3次及第4次免疫接種后抗體水平上升明顯,之后2次免疫后血清抗體水平非常接近。尿液檢測(cè)、HE及普魯士藍(lán)染色顯示Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗沒有明顯的副作用。免疫組化提示免疫治療后Tg-APPs

8、we/PSEN1dE9鼠海馬及皮層區(qū)平均Ap沉積所占面積百分比依次為:對(duì)照組＞Aβ1-42組＞Aβ3-10組＞C57BL/6J組,皮層區(qū)＞海馬區(qū)。體外脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯示當(dāng)Aβ1-42組及Aβ3-10組分別給予其相對(duì)應(yīng)的免疫抗原刺激時(shí)能產(chǎn)生增殖率高(p＜0.05),并且高于ConA刺激產(chǎn)生的增殖率;當(dāng)分別給予非對(duì)應(yīng)免疫抗原刺激時(shí),產(chǎn)生的增殖率低于陽(yáng)性對(duì)照ConA刺激產(chǎn)生的增殖率(p＞0.05);在對(duì)照組中Aβ(3-10)4多肽和Aβ

9、1-42多肽刺激產(chǎn)生的增殖率都明顯低于ConA刺激產(chǎn)生的增殖率(p＜0.05)。細(xì)胞因子檢測(cè)提示只有在增殖反應(yīng)中給予相對(duì)應(yīng)的免疫抗原才能檢測(cè)到較高水平的IL-4、IFN-γ(p＜0.01),并且β3-10組IFN-γ水平低于Aβ1-42組(p＜0.05)。腦組織勻漿中IL-4、IFN-γ水平在Aβ1-42組、Aβ3-10組及對(duì)照組之間比較無(wú)差異(p＞0.05),但顯示了依次遞減的趨勢(shì)。免疫組化結(jié)果提示GFAP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞所占面積百分比

10、依次為:對(duì)照組＞Aβ1-42組＞Aβ3-10組＞C57BL/6J組(p＜0.05),皮層區(qū)＞海馬區(qū)(p＜0.05),被激活的AC數(shù)量及分布與Aβ沉積數(shù)量及分布部位呈明顯相關(guān)性,并且GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分布于Aβ沉積形成的老年斑的周圍及內(nèi)部,對(duì)Aβ沉積呈現(xiàn)明顯的趨向聚集現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 Aβ3-10重復(fù)10次片段與載體pcDNA3.1及真核表達(dá)增效劑CPG成功連接,提示構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-(Aβ3-10)10-

11、CPG成功。Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗肌肉注射免疫Balb/c鼠,在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到抗Aβ抗體,并且抗體滴度隨免疫次數(shù)增高而增加,提示具備免疫原性。
　　 Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗免疫Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠同樣具有較好的免疫原性,無(wú)明顯副作用。Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒與Aβ多肽免疫治療改善學(xué)習(xí)及記憶能力相似。Aβ3-10組的總平均潛伏期、穿平臺(tái)次數(shù)及穿越第一象限次數(shù)都優(yōu)于Aβ1-42組,雖然差異不顯著,但仍可

12、顯現(xiàn)Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗免疫對(duì)12月齡Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠行為學(xué)改善略強(qiáng)于Aβ1-42組的趨勢(shì)。各組之間的Aβ沉積量及分布變化充分顯示Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗及Aβ多肽疫苗免疫治療有效,并且Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒疫苗免疫清除Aβ沉積效果優(yōu)于Aβ多肽疫苗。
　　 Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫雖然也可以產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫,但不會(huì)產(chǎn)生與Aβ1-42多肽免疫所產(chǎn)生的相同的致命的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。

13、Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫及Aβ1-42多肽免疫誘導(dǎo)Th2細(xì)胞免疫程度相當(dāng),但Aβ3-10重復(fù)片段質(zhì)粒免疫與Aβ1-42多肽免疫相比較:下調(diào)了Th1細(xì)胞免疫,減少了非特異性的細(xì)胞毒性的T細(xì)胞免疫,并且降低了炎性細(xì)胞因子IFN-γ的分泌。免疫組化結(jié)果提示Aβ沉積誘發(fā)了Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠腦內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),被激活的AC數(shù)量及形態(tài)與Aβ沉積量正相關(guān),隨著Aβ沉積清除數(shù)量增多而增多,并且隨著腦內(nèi)Aβ沉積量的減少,腦內(nèi)被激活的