酵母核修飾基因MSS1調控線粒體15S rRNA C1477G突變相關的新霉素敏感性及機制研究.pdf

1、線粒體功能受線粒體基因、核基因以及環(huán)境因素等調控。酵母線粒體15SrRNAC1477G是人線粒體12SrRNAA1555G的同源突變，A1555G突變被認為是氨基糖苷類抗生素誘導及非綜合征耳聾的重要因素之一，但是僅有A1555G突變并不一定導致耳聾發(fā)生，還與核修飾基因、氨基糖苷類抗生素等密切相關。以前的研究主要針對單個因素，或者線粒體基因與核基因、線粒體基因與環(huán)境因素兩者之間的作用，有關三者間的相互作用及致病機制尚不明確。
　　

2、 本論文以酵母為模型，利用已構建的線粒體15SrRNA野生型(PS)、C1477G突變型(PR)，和/或核修飾基因MSS1野生型(MSS1)、突變型(mss1)四種菌株:MSS1(Ps)、mss1(Ps)、MSS1(PR)、和mss1(PR)，觀察它們在葡萄糖培養(yǎng)基(GYP)中的氨基糖苷類抗生素敏感性。結果顯示:攜野生型線粒體DNA(PS)時，MSS1突變與否并不影響酵母菌株的正常生長，即表現(xiàn)為新霉素不敏感性。攜線粒體15SrRNAC1

3、477G突變(PR)時，MSS1野生型菌株MSS1(PR)的生長受到顯著抑制，即表現(xiàn)為新霉素敏感性;而MSS1突變型菌株mss1(PR)的生長也受到抑制，但抑制程度較低，表現(xiàn)為新霉素敏感性下降。因此，我們提出研究假說:MSS1基因突變降低了酵母mtDNAC1477G突變引起的新霉素敏感性。進而深入研究了mtDNAC1477G突變、核修飾基因MSS1和氨基糖甙類抗生素三者間的相互作用，初步揭示其表型表達的調控機制。主要內容如下:
　

4、　 1、攜線粒體15SrRNAC1477G突變菌株表現(xiàn)出新霉素敏感性表型。攜mtDNAC1477G突變的菌株，在含新霉素的葡萄糖培養(yǎng)基中氧氣消耗速率相比在葡萄糖培養(yǎng)基中降低了約60％，有極顯著性變化，表明線粒體功能出現(xiàn)了障礙;另外，在含新霉素的培養(yǎng)基中，菌株糖酵解途徑中(己)糖激酶基因HXK2的表達顯著性降低，丙酮酸激酶基因PYK1的表達極顯著性降低，進而降低了菌株的糖酵解作用。菌株線粒體功能的障礙和糖酵解作用的降低，使其不能有充足的

5、能量維持生長，從而表現(xiàn)出新霉素敏感性的表型。
　　 2、核修飾基因MSS1突變抑制了線粒體15SrRNAC1477G突變相關的菌株新霉素敏感性。在含新霉素的葡萄糖培養(yǎng)基中，相比攜mtDNAC1477G突變的菌株的氧氣消耗速率，同時攜C1477G突變與MSS1基因突變的菌株mss1(PR)氧氣消耗速率降低了約61.6％，有極顯著性變化;線粒體基因的表達也出現(xiàn)了不同水平的降低，這說明菌株的線粒體功能進一步降低。但是，糖酵解途徑三個關

6、鍵性激酶基因的mRNA表達增高，其中PFK1和PYK1基因的表達極顯著性增高，HXK2的表達顯著性增高，促進了糖酵解作用，產生的能量彌補了線粒體功能缺陷而導致的能量減少，并且維持了菌株生長所需的能量，表現(xiàn)出新霉素不敏感性的表型。另一方面，菌株mss1(PR)新霉素抗性基因NEO1，NEO6和NEO7的表達水平沒有顯著性變化，新霉素的攝入量也沒有顯著變化，這表明新霉素抗性基因的表達及新霉素的攝取與MSS1基因突變抑制mtDNAC1477G

7、突變相關的新霉素敏感性無關。
　　 3、HAP(heme-activatedprotein)復合體中的HAP5介導mss1(PR)菌株中的糖酵解水平提高。在含新霉素的培養(yǎng)基中，mss1(PR)菌株中HAP復合體中HAP5的mRNA表達顯著性增加，上調了糖酵解基因的轉錄因子GCR1等的表達，進而使糖酵解基因的表達增加(如糖酵解關鍵性激酶基因HXK2，PFK1和PYK1)，促進其糖酵解作用。通過構建HAP5基因敲除及過表達菌株，相關