TLR4乙?；?甲基化修飾激活對炎癥免疫的調(diào)節(jié).pdf

1、Toll樣受體4(Toll Like Receptor4,TLR4)在巨噬細胞的抗感染(特別是抗病毒)過程中發(fā)揮重要作用。TLR4可與配體革蘭陰性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)結(jié)合,并與MD2、CD14兩個分子形成MD2／TLR4／CD14復合體而活化?；罨腡LR4激活兩條經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導通路:一條是MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導路徑,主要接頭蛋白為MaL(TIRAP)和MyD88,TLR4通過招募Mal(TIRA

2、P)／Myd88,激活一系列蛋白酸磷酸化激酶(如TAK1、IKKγ,IKKα,IKKβ)、導致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活并入核而啟動炎癥因子基因表達.這些炎癥因子如白介素6(Inter leukin6.IL6)、IL12、IL17、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)的表達釋放參與巨噬細胞的炎癥免疫反應。另一條是MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑,其主要接頭蛋白為TRAM和TRIF。TLR4通過招募TRAM／

3、TRIF,激活另一些蛋白酸磷化激酶(如TBK1、IKKε／IKK())、導致轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3(IFN-regulatedfactor3,IRF3)激活并入核,來誘導包括干擾素β(Interferon beta,IFNβ)的轉(zhuǎn)錄,最終引起免疫反應。
　　 絲氨酸磷酸化被認為在TLR4的信號通路(尤其在兩條通路的中下游)的激活,起到了至關(guān)重要的作用.然而至今為止,TLR4和TLR4的接頭蛋白是如何被激活的,卻毫無所知。最近,

4、本實驗室率先報道的蛋白乙?；瘏⑴cⅠ型干擾素受體信號轉(zhuǎn)導(Ref)為TLR4上游信號轉(zhuǎn)導通路得激活提供了極為重要的線索。本論文研究證實了乙?；图谆揎棇PS引起的TLR4信號通路的激活,細胞因子合成釋放以及巨噬細胞的炎癥免疫調(diào)控功能具有重大的生物學意義。
　　 (一)TLR4乙?；揎椩贚PS活化的炎癥信號轉(zhuǎn)導中的作用
　　 1、LPS刺激巨噬細胞系Raw264.7細胞后,利用泛乙?；贵w進行免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)TLR4

5、可發(fā)生乙?；揎?。免疫熒光法和免疫共沉淀法證實LPS刺激可促進CBP出核并與TLR4相互作用；抑制內(nèi)源CBP表達后,TLR4乙?；@著降低,表明CBP介導TLR4的乙酰化修飾。為探索TLR4乙?；揎椢稽c,我們構(gòu)建了兩個突變體即第732位和第813賴氨酸(K)分別突變?yōu)榫彼?R)(K732R,K813R),并與CBP共表達后檢測乙?；潭?。結(jié)果表明,與野生型TLR4相比,兩個突變體的乙?；潭蕊@著降低。質(zhì)譜法檢測到TLR4第813位K

6、發(fā)生乙?；揎?。此外,我們分別制備了K732和K813乙酰化修飾的特異性抗體,發(fā)現(xiàn)LPS刺激后TLR4的K732和K813乙?；@著升高。以上結(jié)果表明,LPS刺激可促進CBP介導的TLR4第732位和第813位賴氨酸的乙?；揎棥?br>　　 2、應用免疫共沉淀法分析TLR4及其兩個突變體K732R和K813R與TRAM、TRIF和MyD88三個接頭蛋白的相互作用,結(jié)果表明,K732R突變阻斷了TLR4與TRIF和MyD88的相互作用

7、,而K813R突變阻斷了TLR4與TRAM的相互作用。報告基因技術(shù)分析顯示CBP過表達后,TLR4乙?；潭仍鰪?導致NF-κB和IRF3反應元件活性增加。相反,K732R和K813R突變均可降低IRF3反應元件的活性,而K732R突變則還可以使NF-κB反應元件活性降低。在TLR4-／-小鼠骨髓來源的巨噬細胞(Bone Marrow-Derived Macrophage,BMDM)中,應用半定量RT-PCR的方法分析了乙?；瘜LR4

8、兩條不同通路終產(chǎn)物的影響,結(jié)果顯示,K732R和K813R突變可分別抑制IFNβ的合成釋放,而K732R突變還可抑制IL6合成釋放。以上結(jié)果表明TLR4第732位和第813位賴氨酸的乙酰化分別調(diào)控下游不同的信號通路。
　　 3、LPS刺激巨噬細胞系Raw264.7細胞,利用泛乙?；贵w進行免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)IRF3可發(fā)生乙?；揎?。抑制內(nèi)源CBP表達后,IRF3乙?；@著降低,表明CBP介導IRF3的乙?；揎?。為探索IRF3乙酰

9、化修飾位點,我們用質(zhì)譜法檢測到IRF3第77位的K發(fā)生乙酰化修飾。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了突變體K77R,并與CBP共表達后檢測乙酰化程度。結(jié)果表明,與野生型IRF3相比,突變體的乙?；潭蕊@著降低。免疫印記法分析表明,加入去乙?；?(Histone Deacetylase6,HDAC6)后,CBP／P300介導的IRF3的乙酰化程度顯著下降,表明HDAC6介導IRF3的去乙?；?。免疫共沉淀法結(jié)果顯示K77R突變阻斷了IRF3二聚體的形

10、成,而去乙?；傅囊种苿┣乓志?Trichostatin A,TSA)和煙酰胺(Nicotinamide,NAM)則增強IRF3二聚體間的相互作用。免疫熒光法證實抑制內(nèi)源CBP和K77R突變均能阻止IRF3入核。以上結(jié)果表明LPS誘導的乙?；龠MIRF3形成二聚體然后進入細胞核。
　　 主要結(jié)論:(1)LPS通過CBP介導TLR4第732位和第813位賴氨酸發(fā)生乙?；揎棧?2)TLR4第732位賴氨酸的乙?；瘏⑴c了MyD8

11、8和TRAM／TRIF介導的信號通路的活化,而第813位賴氨酸的乙?；瘎t僅僅參與了TRAM／TRIF介導的信號通路的活化；(3)LPS誘導第77位賴氨酸的乙?；龠MIRF3形成二聚體進入細胞核。
　　 (二)TLR4甲基化修飾在LPS活化的炎癥信號轉(zhuǎn)導中的作用
　　 1、免疫共沉淀法分析表明TLR4可以與IRF3直接相互作用。LPS刺激巨噬細胞系Raw264.7細胞,利用泛甲基抗體進行免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)TLR4可發(fā)生甲基化

12、修飾。為探索TLR4甲基化修飾位點,我們構(gòu)建兩個突變體R731K,R812K,并與甲基化轉(zhuǎn)移酶PRMT2共表達后檢測甲基化程度。結(jié)果表明,與野生型TLR4相比,兩個突變體的甲基化顯著降低。以上結(jié)果表明,LPS刺激可促進PRMT2介導的TLR4第731位和第812位精氨酸的甲基化修飾
　　 2、應用免疫共沉淀法分析TLR4及其兩個突變體R731K和R812K與IRF3的相互作用,結(jié)果表明,R812K突變阻斷了TLR4與IRF3的相

13、互作用。IRF3 R285K的突變也阻斷TLR4與IRF3的相互作用.報告基因技術(shù)分析表明PRMT2過表達后,TLR4甲基化程度增強,導致IRF3反應元件活性增加。相反,R812K突變則降低IRF3反應元件的活性。在BMDM細胞中,用定量RT-PCR的方法檢測了甲基化對TLR4-IRF3信號通路終產(chǎn)物的影響,結(jié)果顯示,TLR4 R812K突變抑制IFNβ的合成釋放。同樣的結(jié)論在在293T細胞中也獲得。以上結(jié)果表明,TLR4第812位精氨

14、酸甲基化參與了IRF3的活化及其與TLR4的相互作用。
　　 3、LPS刺激巨噬細胞系Raw264.7細胞,利用泛甲基抗體進行免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)IRF3可發(fā)生甲基化修飾。為探索IRF3甲基化修飾位點,我們構(gòu)建了突變體R285K,并與PRMT2共表達后檢測甲基化程度。結(jié)果表明,與野生型IRF3相比,突變體的甲基化程度顯著降低。免疫共沉淀法和免疫熒光法證實R285K突變阻斷了IRF3二聚體的形成并且阻止其進入細胞核。以上結(jié)果表明,LP